补肝健腰方对腰椎间盘退变大鼠髓核组织TNF-α、IL-1β干预作用的研究

仇湘中，蒋盛昶，张信成，严 敏，唐 皓，蒋益兰*，王 威

（湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006）

补肝健腰方对腰椎间盘退变大鼠髓核组织TNF-α、IL-1β干预作用的研究

仇湘中，蒋盛昶，张信成，严 敏，唐 皓，蒋益兰*，王 威

（湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006）

目的观察补肝健腰方对腰椎间盘退变大鼠髓核组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)表达的干预作用，探讨补肝健腰方防治腰椎间盘退变的疗效机制。方法40只10月龄SD大鼠随机分为造模组30只、假手术组10只；采用纤维环穿刺法建立椎间盘退变模型，造模组造模成功后随机分为模型组、补肝健腰方组、布洛芬组，每组各8只。造模成功给药6周后检测大鼠髓核组织TNF-α、IL-1β的表达水平。结果模型组腰椎间盘髓核组织TNF-α、IL-1β表达较假手术组增高，差异均有非常显著性意义（P＜0.01）；补肝健腰方组腰椎间盘髓核组织TNF-α、IL-1β的含量均低于模型组，差异均有明显统计学意义（P＜0.01）；布洛芬组腰椎间盘髓核组织IL-1β的含量低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论补肝健腰方可能是通过抑制大鼠退变腰椎间盘髓核组织中致炎因子TNF-α、IL-1β的表达来减轻腰椎间盘的退行性改变。

腰椎间盘退变；补肝健腰方；肿瘤坏死因子-α；白介素-1β；大鼠

补肝健腰方是我院骨伤科临床用于治疗腰椎间盘突出症及椎间盘源性腰痛的有效经验方[1-2]，为探明其机制，本文基于大鼠腰椎间盘退变模型，探讨补肝健腰方对退变腰椎间盘组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)的干预作用，现将方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SD大鼠40只，雌雄兼用，体质量250～300 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(湘)2012-0027。

1.1.2 药物 补肝健腰方处方来源于湖南省中医药研究院附属医院骨伤科，药物组成：炒枣仁20 g，当归10 g，川芎12 g，延胡索20 g，白芍20 g，熟地黄20 g，木瓜20 g，杜仲20 g，蜈蚣4 g，全蝎6 g，甘草6 g，药物均购于湖南省中医药研究院附属医院，常规煎煮，冰箱内冷藏48 h，将冷藏液离心，上清液滤过，得混悬药液浓度为含生药21.6 g/ 10 mL，5℃保存备用。阳性对照药物布洛芬，由中美史克公司生产，规格为每粒0.3 g，配制成含生药10.7 mg/10 mL混悬液，批号：20110901，国药准字H10900089。

1.1.3 主要试剂 青霉素钠注射剂：80万U/支，华北制药股份有限公司，批号：F2503426。0.9%氯化钠注射液：国药集团容生制药有限公司，批号：1207301-031。灭菌注射用水：国药集团容生制药有限公司，批号：1204514-B11。

1.1.4 主要仪器 HM335E型切片机，德国MICROM公司；AP280-123型包埋机，德国MICROM公司；Eclipse.E2OO型光学显微镜，日本Nikon公司；透射电子显微镜JEM-1230型，日本电子公司；微型高速离心机，上海安亭科学仪器设备厂；Multiskan MK3型酶标检测仪，芬兰雷勃公司；解剖显微镜：K-400L麦克奥迪实业集团中国有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 动物适应性饲养1周后，40只SD大鼠按随机数字表法分为造模组30只、假手术组10只。

1.2.2 造模方法 采用纤维环针刺法[3]复制动物模型。10%水合氯醛(3 mL/kg）腹膜内麻醉，剪毛、左侧卧位固定大鼠、消毒、铺无菌巾。取右腹后外侧正中切口长约2 cm，腹外斜肌与背肌之间剪开，腹膜外入路到达椎体右侧方，依据髂嵴定位(平L6椎体)，暴露L3-4、L4-5、L 5-6椎间隙，用16 G穿刺针头，由椎间盘纤维环前外侧方平行终板，与脊柱矢状面呈约450角方向刺入L4-5，深度控制在2.3 mm,行全层针刺，维持10 s后拔针,术毕逐层缝合创口。假手术对照组：仅切开皮肤后缝合。并连续3 d各组大鼠均腹腔注射青霉素钠盐20万 U/kg，每天1次，以预防切口感染。术后各组大鼠在23～25℃环境中，同等正常条件下单笼标准饲料喂养6周。

1.2.3 给药方法 造模成功单笼常规饲养6周后，开始灌胃给药，中西药服药剂量按成人体质量70 kg等剂量计算大鼠用药剂量。补肝健腰方组：灌胃体积10 mL/kg，给药剂量为3.9 g/（kg·d），连续6周；布洛芬组：灌胃体积10 mL/kg，给药剂量为0.1 g/（kg·d），连续6周；模型组及假手术组则每日灌予同等量饮用水，连续6周。两种药物的总量均分早、晚两次灌服。

1.2.4 标本收集 给药6周，末次给药后12 h，所有大鼠均采用腹腔注射过量10%水合氯醛麻醉处死大鼠，沿上、下软骨终板与椎体的交界面完整切取大鼠L4-5椎间盘，置于-80℃冰箱保存待测。

1.2.5 检测指标及方法 造模手术6周后，造模组和假手术对照组各随机抽取2只大鼠进行光镜下椎间盘的组织形态学观察，再各随机抽取2只大鼠进行电镜下椎间盘的超微结构观察；采用酶联免疫吸附测定法 (ELISA)进行TNF-α、IL-1β含量的测定，标本送长沙维尔生物科技有限公司检测。

1.2.6 统计学方法 使用SPSS 19.0统计软件进行处理。计量资料采用“±s”表示，方差齐采用单因素方差分析，若方差不齐采用Tamhane＇s T2，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模过程中大鼠死亡情况

造模期间死亡大鼠3只，其中假手术组1只，模型组2只。再采用随机数字表法将造模组造模成功大鼠24只分为模型组、补肝健腰方组、布洛芬组，每组各8只。

2.2 各组大鼠椎间盘超微结构光镜下观察结果

假手术组（封三彩图图1-A）见椎间盘髓核结构完整，纤维板菲薄，软骨细胞规则增生，髓核处见软骨细胞增生，依稀可辨髓核结构，大鼠经6周喂养，为16月龄大鼠，其椎间盘开始出现正常的轻度退变；模型组（封三彩图图1-B）纤维板基本被软骨成分取代，排列不规则，还可见骨小梁形成,髓核结构消失;布洛芬组（封三彩图图1-C）可见纤维板断裂髓核部分水肿,周边有软骨细胞反应性增生;补肝健腰方组（封三彩图图1-D）可见残存的纤维板结构，纤维板局灶性不规则软骨增生,髓核结构模糊可见。

2.3 各组大鼠椎间盘超微结构电镜下观察结果

2.3.1 假手术组 可见正常的软骨样细胞,其细胞膜完整、光滑,细胞器正常；胶原原纤维平行排列、整齐、规则、纵横交错、大小及方向一致,可见明暗相同的周期性横纹,着色均匀。胶原纤维未见交织在一起，无团块样结构出现。未见到高电子密度细颗粒的钙化点。见图2-A。

2.3.2 模型组 细胞数量稀少，多数呈现不同程度的退变或死亡，较多胶原原纤维变性、交织在一起，扭结呈毛线团或髓鞘状，亦可见呈指纹状结构或堆聚成片块状，内部含较高电子密度的细颗粒的钙化点，边缘变粗糙模糊，横纹消失，内部结构亦模糊不清。见图2-B。

2.3.3 布洛芬组 细胞数量较少，可找到存活的软骨样细胞，其细胞膜尚完整，细胞器基本正常，胶原原纤维排列较致密，方向欠规则，粗细不均，可见周期性横纹，内部少见含较高电子密度的细颗粒的类似钙化点。见图2-C。

2.3.4 补肝健腰方组 髓核细胞退变较轻，死亡细胞较少，可见基本正常的软骨样细胞及少量形态异常的软骨样细胞，存活的软骨样细胞甚至有增生现象，其细胞膜完整，细胞器基本正常；胶原原纤维有明显、规则的横纹，变性轻。见图2-D。

图2 各组大鼠椎间盘超微结构透射电镜观察结果图（×5000）

2.4 各组大鼠腰椎间盘髓核组织中TNF-α、IL-1β含量比较

补肝健腰方组、布洛芬组、模型组腰椎间盘髓核组织TNF-α、IL-1β的含量均高于假手术组，差异均有显著的统计学意义（P＜0.01）；补肝健腰方组腰椎间盘髓核组织TNF-α、IL-1β的含量均低于模型组，差异均有显著的统计学意义（P＜0.01）；布洛芬组腰椎间盘髓核组织IL-1β的含量低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。补肝健腰方腰椎间盘髓核组织TNF-α、IL-1β的含量与布洛芬组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1 实验6周后大鼠腰椎间盘髓核组织中TNF-α、IL-1β含量比较 （±s，ng/L）

表1 实验6周后大鼠腰椎间盘髓核组织中TNF-α、IL-1β含量比较 （±s，ng/L）

注：与假手术组组比较＃＃P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别假手术组模型组补肝健腰方组布洛芬组n 5 8 8 8 TNF-α 3.24±1.67 12.13±2.39＃＃9.16±2.49＃＃△△10.87±2.56＃＃IL-1β 2.36±0.41 9.53±1.22＃＃7.63±1.51＃＃△△8.02±1.37＃＃△

3 讨论

近年来中医中药辨证已广泛应用于椎间盘退变的治疗[4]。椎间盘退变的病机不外虚实两端，虚实夹杂，以虚为主。虚乃脏腑虚损，尤其肝虚是主要原因；实以风、寒、湿外邪入侵、劳伤以及痰、瘀等病理产物为主。肝主筋，筋附骨，中年以上肝肾渐衰，肝虚则筋失滋荣，久则骨失所养，加之外伤及风寒湿邪侵袭及外伤瘀血留着不去，经络不通、气血痹阻，脏腑失养，久则骨质变形，节挛筋缩而发病。根据中医药理论和多年临床经验，本课题组首次提出了“椎间盘源性腰痛从肝虚瘀阻论治”的观点，组方补肝健腰方开展临床研究，取得良好的效果[1-2]。方中炒枣仁“补中益肝，坚筋骨，助阴气”，有养肝、宁心之效，为君药；熟地黄滋阴养血，杜仲甘温补益，平补肝肾，润肝燥，强腰脊，共为臣药；当归补血养肝，白芍养血柔肝和营，川芎活血行气，调畅气血，蜈蚣辛温走窜，通经逐邪，有调达肝经、通络止痛之功，全蝎味辛，与蜈蚣配伍则通络止痛之效倍增；延胡索活血、理气、止痛，木瓜舒筋活络共为佐药；甘草调和诸药，为使药。诸药合用具补肝养血、活血通络之效。现代药理研究也已证实，上述诸药有抗炎、镇痛和免疫调节作用，可降低毛细血管通透性，改善微循环，消除神经水肿及肌肉痉挛，增强人体抵抗力，缓解对神经根的化学及自然免疫刺激等作用。

椎间盘退变是一个动态的复杂过程，引起退变的确切原因尚不清楚，研究发现椎间盘中的细胞因子在椎间盘退行性变的病理过程中发挥重要的作用，目前，已知的细胞因子有100多种，其中，IL-1、IL-6、TNF-α、NO等被公认为是参与椎间盘退变的最重要的细胞因子[5]。研究显示：TNF-α、IL-1与椎间盘退变关系密切[6]，有足够的证据表明它们均参与椎间盘退变的过程[7]，且两者参与椎间盘的退变过程有相同的增高趋势[8]。大量研究表明：IL-1β通过诱导基质金属蛋白酶的表达，从而降解蛋白多糖；通过刺激分泌一氧化氮(NO)，抑制前列腺素(PG)的合成，而参与椎间盘退变所致神经根痛的病理过程[9]；TNF-α可促使血管生成诱导因子如血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-7及血浆酶的产生，从而使蛋白多糖减少，椎间盘组织被吸收[10]。

本研究通过动物实验发现，补肝健腰方能抑制腰椎间盘髓核组织中TNF-α、IL-1β的表达，说明补肝健腰方对于机体内细胞因子有调节作用，可抑制炎性物质的释放，也初步提示，补肝健腰方极有可能是通过抑制IL-1β、TNF-α的合成和分泌发挥其延缓椎间盘退变的作用。

[1]张旭桥，匡建军，张信成，等.仇湘中教授治疗脊柱退行性病变的经验[J].中医药导报，2013(5)：30-31.

[2]仇湘中，夏爱民，阚利胜，等.胶原酶溶解术合养肝健腰方治疗腰椎间盘突出症60例[J].湖南中医杂志，2009，25(6)：31.

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[4]邱红明，孙 鲁，李 静，等.间盘源性下腰痛的诊断与辨证治疗[J].山东中医杂志，2005，24(9)：536-537.

[5]李 茂，彭宝淦.细胞因子在椎间盘退变中作用的研究进展[J].中国矫形外科杂志，2012，20(21)：1 960-1 962.

[6]樊国峰，刘创建，王 丹，等.白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α与腰椎间盘退变的研究进展 [J].河北医科大学学报，2008，29(4)：624.

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[10]刘 阳，朱立新.细胞因子和炎性介质对腰椎间盘退变的作用[J].颈腰痛杂志，2010，31(1)：57-58.

（本文编辑 匡静之）

Study of the Intervention of Bugan Jianyao Decoction on TNF-αand IL-1β of the Nucleus Pulposus in Rats w ith Lumbar Disc Degeneration

QIU Xiangzhong，JIANG Shengchang,ZHANG Xincheng,YAN Min,TANG Hao,JIANG Yilan*,WANG Wei
（Affiliated Hospital of Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410006,China）

ObjectiveThe preventive effects of Bugan Jianyao decoction on TNF-αand IL-1βexpressions in rats with lumbar spine degeneration were observed.The efficacy mechanization of the Bugan Jianyao decoction in treatment of lumbar disc degeneration was explored.Methods40 10-month-old SD rats were random ly divided into model group and the sham-operation group,with 30 and 10 respectively.The lumbar spine degeneration models were established by annulus puncture.After the successful modeling,the rats were random ly divided into model group,Bugan Jianyao decoction group and ibuprofen group,with 8 in each group.The expression levels of TNF-α,IL-1βin nucleus pulposus of lumbar disc tissue were detected after six-month administration.ResultsThe expression of TNF-α,IL-1βin nucleus pulposus of lumbar disc in the model group was increased compared with sham-operation group,and the differences were very significant(P<0.01);the expression of TNF-α,IL-1βin nucleus pulposus of the lumbar disc in Bugan Jianyao decoction group were lower than the model group,and the differences were statistically significant(P<0.01);The level of IL-1βin the ibuprofen group was lower than the model group,and the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionBugan Jianyao decoction can reduce degenerative changes in the lumbar intervertebral disc by inhibition TNF-αand IL-1βin nucleus pulposus of the lumbar disc of rats.

lumbar disc degeneration；Bugan Jianyao decoction;TNF-α;IL-1β;rats

R285；R681.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.005

2014－10－26

湖南省科技厅科研基金（2014SK3049）；湖南省教育厅科研基金（14C0865）；湖南省卫生厅中医药科研基金（2010055）。

仇湘中，主任医师，教授，第五批全国名老中医学术思想继承指导老师，第三批湖南省名中医，主要从事中医骨伤科临床、科研、教学工作。

*蒋益兰，主任医师，教授，博士生导师，E-mail：2267811679@qq.com。