姜黄素调节Bcl-2、Bax蛋白表达诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡

周 曙，田 芳，金海蓉，王绪国，李 超，胡晋红*

（第二军医大学长海医院药学部，上海 200433）

姜黄素调节Bcl-2、Bax蛋白表达诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡

周 曙，田 芳，金海蓉，王绪国，李 超，胡晋红*

（第二军医大学长海医院药学部，上海 200433）

目的研究姜黄素诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡及其分子机制。方法用10、20、40μmol/L姜黄素 （对照组0μmol/L）处理增生性瘢痕成纤维细胞24 h，MTT法检测姜黄素对细胞增殖的影响，Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率，分光光度法检测Caspase-9、Caspase-3活性，Western Blot法检测Bcl-2、Bax蛋白表达。结果MTT结果显示姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞具有抑制作用，抑制率随姜黄素浓度增加而上升（P＜0.05）；Annexin V-FITC/PI双标法结果显示成纤维细胞凋亡率随姜黄素浓度增加而上升（P＜0.05）；经姜黄素作用，Caspase-9、Caspase-3的活性随姜黄素浓度增加而升高（P＜0.05）；Western Blot结果显示Bcl-2蛋白表达下降，Bax蛋白表达升高，Bax/Bcl-2比值增大，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用，其机制与下调Bcl-2蛋白表达、上调Bax蛋白表达，升高Caspase-9、Caspase-3活性有关。

姜黄素；增生性瘢痕；成纤维细胞；细胞凋亡；Bcl-2；Bax；Caspase-9；Caspase-3

增生性瘢痕（Hypertrophic Scar）是在创伤、烧伤后皮肤真皮愈合时，局部瘢痕组织过度修复出现的高出皮面、发红、发硬的病理结构。增生性瘢痕的形成机制尚未完全清楚，现认为皮肤成纤维细胞是伤口愈合和瘢痕增生的主要效应细胞，其过度增殖、合成细胞外基质异常，直接导致增生性瘢痕的形成[1]。临床上常采用手术、药物注射、激光、冷冻、加压、中医辨证施治等方法综合治疗，但至今尚无特效疗法、特效药物。瘢痕患者皮肤形态畸形和功能障碍，同时面临心理、社会问题，研究增生性瘢痕的形成机制和防治药物具有重要的临床意义[2]。

姜黄素（Curcumin）是姜科姜黄属（Curcuma L.）植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然植物多酚，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗纤维化、降血脂、抗动脉粥样硬化等多种药理作用[3]，且毒性低，具有良好的临床应用前景。有研究表明姜黄素能诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡，具有体外抗增生性瘢痕的作用[4]，但是具体的凋亡作用机制尚未明确。本研究以体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞为研究对象，采用不同浓度的姜黄素进行干预，探讨姜黄素诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的效应及其分子机制，为姜黄素用于临床治疗增生性瘢痕提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

姜黄素、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；MTT试剂盒购自美国Promega公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、Caspase-9和Caspase-3活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人Bcl-2、Bax、β-actin多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。主要仪器：倒置显微镜，日本Olympus公司；细胞培养箱，美国Thermo公司；酶标仪，美国BTO-Rad公司；流式细胞仪，德国Miltenyi Biofec公司；凝胶图像分析系统，上海天能公司。

1.2 增生性瘢痕成纤维细胞培养

增生性瘢痕组织来源于第二军医大学附属长海医院整形外科增生性瘢痕患者的手术标本，患者术前未作任何抗瘢痕治疗，无系统疾病，均经临床和病理确诊，收集标本前都已取得患者知情同意，实验经医学伦理委员会批准。取手术切除的增生性瘢痕组织，尽量去除表皮和皮下组织，在无菌条件下漂洗、剪碎，参照组织块贴壁法培养成纤维细胞，置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，37℃、5%CO2的饱和湿度下培养。每天观察细胞贴壁和生长情况，待组织周围有梭形细胞游出，换新培养液继续培养，细胞长满时，用0.25%胰酶消化，按1∶3进行消化传代。实验选用第3～7代细胞。

1.3 MTT法检测细胞增殖抑制

取对数生长期的成纤维细胞，制成5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO2饱和湿度下培养，待细胞完全贴壁后更换为含姜黄素的培养基。分为不同浓度10、20、40μmol/L姜黄素处理组，0μmol/L为对照组，每组做6个复孔。将96孔板置于培养箱中孵育24 h。每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL后在培养箱温育3.5 h，吸取上清，每孔加入150μL DMSO，取培养板，采用酶标仪在490 nm处检测光密度OD值，计算各组细胞生长抑制率。成纤维细胞生长抑制率=(1-姜黄素组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4 Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率

收集经0、10、20、40μmol/L姜黄素处理24 h后的增生性瘢痕成纤维细胞，PBS洗涤，按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书，加入195μL的Binding Buffer重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI，室温下避光、反应15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 Caspase-9、Caspase-3活性检测

收集经0、10、20、40μmol/L姜黄素处理24 h后的增生性瘢痕成纤维细胞，PBS洗涤，加入裂解液，置于4℃下裂解15 min提取总蛋白，测定蛋白浓度并定量。按Caspase-9、Caspase-3活性检测试剂盒配置100μL反应体系，每组做6个复孔，37℃孵育2 h后，用酶标仪在405 nm处检测光密度OD值，根据标准曲线计算活性。

1.6 Western Blot检测Bcl-2和Bax蛋白表达

收集经0、10、20、40μmol/L姜黄素处理24 h后的增生性瘢痕成纤维细胞，PBS洗涤，加入裂解液，置于4℃下裂解15 min提取总蛋白，测定蛋白浓度并定量，用质量分数为12%的SDS-PAGE电泳分离后，转移到PVDF膜上，以质量分数为5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入1∶500稀释的一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入1∶5 000稀释的二抗，室温孵育1 h，洗膜3次。应用ECL法进行显影检测，以Bcl-2、Bax蛋白与内参β-actin蛋白的IOD比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 姜黄素对细胞增殖的抑制作用

MTT结果如表1所示，姜黄素能够抑制增生性瘢痕成纤维细胞的生长，随着浓度的提高，姜黄素对成纤维细胞的增殖抑制效果逐渐增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用（±s，n=6）

表1姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用（±s，n=6）

注：与对照组比较*P＜0.05。下表同。

姜黄素(μmol/L) 0(对照组) 10 20 40 OD 抑制率(%) 1.725±0.081 0 1.053±0.077* 39.0 0.898±0.060* 47.9 0.697±0.053* 59.6

2.2 AnnexinV-FITC/PI双标检测细胞凋亡

对照组细胞凋亡率为 (2.90±0.72)%，10、20、40μmol/L姜黄素组细胞凋亡率分别为 (22.53± 1.67)%、(37.83±1.27)%、(46.21±1.95)%。姜黄素不同浓度组组间比较，高浓度组细胞凋亡率高于低浓度组，凋亡率随着姜黄素浓度的增加而上升（P＜0.05）。结果如图1所示。

图1 AnnexinV-FITC/PI双标检测姜黄素诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡率

2.3 Caspase-9、Caspase-3活性检测

与对照组相比，不同浓度姜黄素可以使增生性瘢痕成纤维细胞Caspase-9、Caspase-3的活性明显升高，并呈浓度依赖性，差异有统计学意义 （P＜0.05）。结果如图2、图3所示。

2.4 姜黄素对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

Western Blot结果显示，随着姜黄素浓度的增加，增生性瘢痕成纤维细胞内，Bcl-2蛋白表达降低，而Bax蛋白表达增加，Bax/Bcl-2比值明显升高（见表2），差异有统计学意义（P＜0.05）。如图4所示。

图2姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞Caspase-9活性的影响

图3姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞Caspase-3活性的影响

图4 姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的电泳图

表2 姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞Bax/Bcl-2比值的影响 （±s，n=3）

表2 姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞Bax/Bcl-2比值的影响 （±s，n=3）

姜黄素(μmol/L) 0 10 20 40 Bcl-2/β-actin 0.63±0.06 0.58±0.12* 0.53±0.08* 0.50±0.17* Bax/β-actin 2.10±0.19 2.58±0.27* 2.83±0.13* 3.11±0.19* Bax/Bcl-2 3.33 4.45* 5.34* 6.22*

3 讨论

增生性瘢痕是皮肤创伤后过度修复的一种不良结果，病理学特点是成纤维细胞过度增殖和胶原蛋白、纤联蛋白、氨基多聚糖等细胞外基质的过度沉积，成纤维细胞是产生胶原的主要细胞，瘢痕中成纤维细胞正常凋亡过程失控是其过度增殖、合成胶原异常的一个重要环节[5]。用药物诱导促使成纤维细胞凋亡，是抗增生性瘢痕治疗的一个很有意义的研究领域，从天然药物活性成分中筛选新的有效药物，在增生性瘢痕的治疗和预防中更是被给予很高期望。

姜黄素是从中药姜黄中提取的一种植物多酚，药理作用广泛[6-7]，对多种肿瘤细胞有拮抗作用，如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌等，其机制之一与诱导肿瘤细胞凋亡有关。由于细胞凋亡的信号途径比较复杂，对于不同的肿瘤细胞，姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的机制也可能不尽相同。在结直肠癌研究中发现，姜黄素通过激活Bax表达、抑制Bcl-2和Bcl-xL表达而活化Caspase-3信号通路，显著抑制人结肠癌LoVo细胞的增殖并促进其凋亡[8]。姜黄素作用于人T细胞淋巴瘤Jurkat细胞，阻滞Jurkat细胞于G0/G1期，激活MAPKs家族中的JNk信号通路诱导Jurkat细胞凋亡[9]。研究发现姜黄素可作为肺、肝纤维化病变的治疗药物，通过调整肺内凋亡相关因子Bcl-xL、Bax、Caspase-3的改变延缓肺纤维化疾病进展，通过促进活化的肝星状细胞凋亡而发挥抗肝纤维化的作用。增生性瘢痕具有纤维化病变的特点，胡晓龙等[4]报道姜黄素能引起增生性瘢痕成纤维细胞凋亡，本研究结果与之较为一致，姜黄素在10～40μmol/L浓度范围内诱导成纤维细胞凋亡，凋亡率随药物浓度增加而增高。本实验进一步研究黄素诱导成纤维细胞凋亡的作用机制，为姜黄素对增生性瘢痕的治疗提供了很好的理论基础。

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，可引起细胞一系列的形态及生物学改变，并最终导致细胞死亡。目前认为线粒体通路、死亡受体通路是参与细胞凋亡的两条主要信号通路，在细胞凋亡的线粒体通路中Bcl-2蛋白家族占有重要地位[8]。Bax、Bcl-2分别是Bcl-2蛋白家族中典型的促凋亡和抑凋亡蛋白，促凋亡蛋白Bax在正常细胞中主要定位于细胞浆，受到凋亡刺激后转位到线粒体上，直接或间接地在线粒体上形成孔道，引起细胞色素C的释放，细胞色素C活化Caspase-9，激活下游的效应Caspase-3，进而启动细胞凋亡。抑凋亡蛋白Bcl-2则能与Bax形成异源二聚体，抑制细胞色素C的释放，具有抑制细胞凋亡的功能。正常情况下Bax、Bcl-2的表达量处于相对的稳态，当Bax占优势时细胞发生凋亡，当Bcl-2占优势时细胞免遭凋亡，Bax/Bcl-2比值改变决定细胞凋亡的发生，是凋亡调控的一个重要因素[10-11]。

本研究发现，姜黄素下调Bcl-2蛋白表达、上调Bax蛋白表达，Caspase-9、Caspase-3活性显著升高，促进了增生性瘢痕成纤维细胞凋亡，这可能是姜黄素治疗增生性瘢痕作用的重要机制之一。但是细胞凋亡调控网络错综复杂，姜黄素是否还通过其他通路共同发挥作用有待进一步研究。目前增生性瘢痕尚无理想的治疗药物，现有药物或因毒性太大、或作用不强，使临床应用受到限制。姜黄素因其毒副作用较小等优势，通过诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡，有望作为治疗增生性瘢痕的潜力药物。

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[4]胡晓龙，胡大海，计 鹏，等.姜黄素对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞的生物学作用[J].第四军医大学学报，2009(1)：76-79.

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[11]Chang Z，Xing J，Yu X.Curcumin induces osteosarcoma MG63 cells apoptosis via ROS/Cyto-C/Caspase-3 pathway[J].Tumour Biol，2014，35(1)：753-758.

（本文编辑 杨 瑛）

Curcum in Induced Hypertrophic Scar Fibroblasts Apoptosis by Regulating Bcl-2/Bax Protein Expressions

ZHOU Shu,TIAN Fang,JIN Hairong,WANG Xuguo,LI Chao,HU Jinhong*
（Department of Pharmacy,Changhai Hospital of Second Military Medical University,Shanghai 200433,China）

ObjectiveTo investigate the effects of curcumin on cell apoptosis in hypertrophic scar fibroblasts and the related mechanism.MethodsThe hypertrophic scar fibroblasts were treated with curcumin of 10 μmol/L,20 μmol/L, 40μmol/L for 24 h.The effects of curcumin on proliferation of hypertrophic scar fibroblasts were detected by MTT assay.The apoptosis rate was analyzed by Annexin V-FITC/PI double staining.The activities of Caspase-9 and Caspase-3 were detected with spectrophotometric method.The protein expression of Bcl-2 and Bax was detected with Western blot assessment.ResultsMTT assay showed that curcumin could inhibit hypertrophic scar fibroblasts proliferation and the inhibitory rate increased with the concentration of curcumin(P＜0.05).Annexin V-FITC/PI double staining showed that curcumin could induce apoptosis of fibroblasts and the apoptosis rate which increased with the concentration of curcumin(P＜0.05).The activities of Caspase-9 and Caspase-3 were increased with the concentration of curcumin(P＜0.05).Western Blot assessment showed that curcumin reduced the Bcl-2 protein expression,increased the Bax protein expression and the ratio of Bax/Bcl-2,the differences had the statistical significance(P＜0.05).ConclusionCurcumin could inhibit proliferation and induce apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts.Its mechanism may be associated with increasing the activities of Caspase-3 and Caspase-9 by inhibiting the expression of Bcl-2 protein and promoting the expression of Bax protein.

curcumin;hypertrophic scar;fibroblasts;apoptosis;Bcl-2;Bax;Caspase-9;Caspase-3

R285.5；R619.6

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.002

2014－11－02

国家自然科学基金资助项目（81173130）。

周 曙，男，在读硕士研究生，主管药师，研究方向：临床药学。

*胡晋红，主任药师，E-mail：hujh2011@163.com。