1株链霉菌产ε聚赖氨酸的结构及分子量分析

刘盛荣,吴清平,张菊梅,莫树平,杨小鹃

(广东省微生物研究所/华南应用微生物国家重点实验室,广东广州 510070)



刘盛荣,吴清平*,张菊梅,莫树平,杨小鹃

(广东省微生物研究所/华南应用微生物国家重点实验室,广东广州 510070)

目的:研究确定1株疑似产ε-聚赖氨酸链霉菌所合成产物的化学结构和分子量。方法:采用D152树脂离子交换法分离纯化ε-聚赖氨酸;薄层色谱分析化学组成;紫外可见扫描光谱分析有机官能团;长程异核位移相关谱分析赖氨酸分子间的键连接方式;Tricine-SDS-PAGE电泳分析ε-聚赖氨酸分子量。结果:薄层色谱显示赖氨酸为纯化产物的惟一化学组成;纯化产物200nm处有最大吸收峰,260～280nm蛋白特征吸收处无吸收;长程异核位移相关谱显示纯化产物为ε-聚赖氨酸;所分离ε-聚赖氨酸分子量约为3300u左右。结论:菌株GIM8发酵产物为ε-聚赖氨酸;薄层色谱、紫外可见扫描光谱以及长程异核位移相关谱三者结合适用于ε-聚赖氨酸的化学组成和结构分析。

链霉菌,ε-聚赖氨酸,化学结构,长程异核位移相关谱,Tricine-SDS-PAGE

ε-聚赖氨酸(ε-poly-l-lysine)是在1977年由日本科学家Shima和Sakai在白色链霉菌(Streptomycesalbulus)发酵液中发现的,通常由25～35个l-赖氨酸残基通过α-羧基与ε-氨基形成的酰胺键连接[1],不同于蛋白分子α-聚赖氨酸。ε-聚赖氨酸抑菌谱广,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、丝状真菌、酵母菌以及病毒等有明显的抑制作用[2-3]。此外动物实验表明ε-聚赖氨酸对人体安全无毒,且可生物降解[4-5],因此,ε-聚赖氨酸十分适合作为安全高效的天然食品防腐剂。在日本,ε-聚赖氨酸常用于面条、米饭、蛋制品、酱类、酱油、鱼片等食品的防腐保鲜[6],美国、韩国等国也已批准其作为食品防腐剂并得到推广应用。目前ε-聚赖氨酸在日本已实现工业化发酵生产。

除作为一种安全高效的天然食品防腐剂外,ε-聚赖氨酸在医药、农业、生物研究、电子工业等领域也发挥重要作用[6]。医药上富含正电荷的ε-聚赖氨酸与阴离子药物具有很强的静电作用,结合后药物极易穿过细胞膜,提高了药物的转运效率和治疗效果[7],也可作为基因载体用于基因治疗[8];农业上通过辐射交联制备ε-聚赖氨酸的水凝胶或者使之与多糖反应制备高吸水性物质作为农业生产的保水剂[9];生物研究中ε-聚赖氨酸可作为细胞促融剂提高细胞的融合效率[10];此外,ε-聚赖氨酸可作为多阵列传感器、纳米级光电纤维等的制作材料[11-12]。

当前食品工业中仍然主要使用化学合成类的防腐剂如苯甲酸及其钠盐、硝酸盐、丙酸钙等进行防腐保鲜,但这些防腐剂对人体健康具有潜在的危害,因此天然来源的抑菌物质由于安全性高受到人们的亲睐,如植物源的茶多酚、香辛料、中草药提取物等;动物源的鱼精蛋白、蜂胶、壳聚糖等;微生物源的乳酸链球菌素、纳他霉素、ε-聚赖氨酸等。与动物、植物源的防腐剂相比较微生物源的ε-聚赖氨酸可通过发酵的方法工业化生产,而且生产过程对环境影响也更小,因此ε-聚赖氨酸的微生物发酵生产更具优势。

ε-聚赖氨酸潜在的巨大商业价值引起了研究人员的关注,我国以及日本等国的研究人员在产生菌筛选[13-17]、发酵工艺[18-20]、生物合成[21-23]以及ε-聚赖氨酸对食源性病原微生物的抑制效应[24-25]等方面开展了大量研究。本课题组采用亚甲基蓝法从土壤中分离到1株疑似产ε-聚赖氨酸的链霉菌,本文研究确证产物的化学结构及分子量,为菌株的工业应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株 链霉菌GIM8;丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、过硫酸胺及TEMED AMRESCO公司;低蛋白分子量Marker 广州瑞斯生物;D152树脂 天津光复精细化工研究所;5cm×20cm硅胶层析板 烟台市化学工业研究所;高氏1号合成培养基 广东环凯微生物科技有限公司;M3G培养基(g/L)[18]葡萄糖50、酵母粉5、(NH4)2SO410、KH2PO41.36、K2HPO40.8、MgSO4·7H2O 0.5、ZnSO4·7H2O 0.04和FeSO4·7H2O 0.03,pH7.2。

EYELA FMC-1000恒温摇床 日本东京理化器械;蛋白质微量电泳仪及Miniprotein Ⅱ垂直电泳槽 美国Bio-Rad;Ultrospec 6300 pro核酸蛋白分析仪 美国Amershan;Bruker DRX-500 MHz核磁共振波谱仪 德国 Bruker光谱仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 摇瓶发酵 用接种环从培养好的斜面刮取一环孢子划线至高氏1号培养基(9cm培养皿),置30℃培养箱,7d后注入5mL无菌水,用接种环刮取培养基表面的孢子使之悬于无菌水制备孢子悬液;吸取1mL孢子悬液至50mL M3G培养基(250mL摇瓶),置温度30℃、转速为190r/min的摇床培养20h作为发酵种子。吸取2mL种子至50mL M3G培养基(250mL摇瓶),培养条件同种子培养,发酵时间72h。

1.2.2 树脂处理 新树脂D152依次用70～80℃去离子水漂洗、乙醇浸泡和去离子水漂洗预处理,置 1mol/L HCl浸泡,不时用玻棒搅拌,4h后倾去酸液,去离子水洗至中性;置1mol/L NaOH浸泡,不时搅拌,4h后倾去碱液,去离子水洗至中性,最后树脂于1mol/L HCl浸泡4h并不时搅拌,倾去酸液,去离子水洗至中性,即为H型备用。

1.2.3 产物纯化 取发酵培养基50mL至离心管,10000×g离心10min,收集上清,以1mol/L NaOH调pH至8.5,静置30min后10000×g离心10min,上清转至含2mL D152树脂的250mL摇瓶,150r/min、30℃吸附30min。用60目尼龙布过滤收集树脂,依次去离子水、0.2mol/L乙酸淋洗,树脂转移至装有20mL 0.1mol/L HCl的250mL摇瓶,150r/min、30℃洗脱30min;用1mol/L NaOH将洗脱液pH调至6.5,静置30min后离心收集上清。上清活性炭脱色1h、离心收集上清,过Sephadex G-25柱除盐得无色透明液体纯化产物,或进一步浓缩、冷冻干燥得到固体纯化产物。

1.2.4 盐酸水解与薄层色谱 吸取1mL液体纯化产物至耐热玻璃管,加入1mL浓盐酸,盐酸终浓度为6mol/L,密封后121℃烘箱水解24h。薄层色谱的展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶吡啶∶水=4∶1∶1∶2(v/v),0.2%茚三酮乙醇溶液为显色剂,毛细管点样,点样量为1μL,层析缸室温层析,展开剂前沿距硅胶板顶端1cm处时取出硅胶板,溶剂室温挥发后喷洒显色剂,90℃烘箱显色。

1.2.5 紫外可见扫描光谱 液体纯化产物适当稀释,用核酸蛋白分析仪扫描190～400nm间光吸收。

1.2.6 长程异核位移相关谱 采用Bruker DRX-500 MHz型超导核磁共振仪测定。样品溶于D2O,TMS作内标,测试温度为室温,采用BBO探头,本测试由中国广州分析测试中心完成。

1.2.7 Tricine-SDS-PAGE电泳

1.2.7.1 电泳溶液配制 参照文献[26-28]。

1.2.7.2 凝胶制作 制备4%浓缩胶及14%分离胶,先铺分离胶,聚合后铺浓缩胶,其余参照[26-28]。

1.2.7.3 上样及电泳 样品进胶前电压设置为80V,待前沿指示剂跑到浓缩胶和分离胶的分界线时,设置电压为120V,电泳40min。

2 结果与分析

2.1 产物纯化

发酵液经纯化后得到无色透明液体;浓缩、真空冷冻干燥后的纯化产物为浅白色固体粉末。液体纯化产物用于紫外可见扫描及薄层色谱分析,固体纯化产物用于长程异核位移相关谱磁共振测试。

2.2 薄层色谱

图1为纯化产物盐酸水解物的薄层色谱图谱,可以看出层析板上只形成1个与标准物赖氨酸相对应的斑点,但由于薄层色谱分辨率相对较低,初步推断赖氨酸为纯化产物的唯一化学组成。

图1 纯化产物盐酸水解物的薄层图谱Fig.1 Profiles of thin layer chromatography of the acid hydrolysate of purified product from Streptomyces sp. GIM8注：A：标准品-赖氨酸;B：盐酸水解物。

2.3 紫外可见光扫描光谱

图2为纯化产物的紫外可见扫描光谱图,可以看出约200nm处有最大吸收,随激发波长增大光吸收急剧下降;260～280nm蛋白质特征吸收处无吸收,结合薄层色谱结果可初步确定纯化产物不是α-聚赖氨酸,为ε-聚赖氨酸。

图2 纯化产物的紫外可见扫描光谱Fig.2 UV-VIS scanning spectrum of the product isolated from Streptomyces sp. GIM8

2.4 长程异核位移相关谱

图3为纯化产物的长程异核位移相关谱。显而易见聚赖氨酸(ε-聚赖氨酸或α-聚赖氨酸)的羰基碳具有最大的化学位移(圈处),谱图中可以看出其与不同质子的耦合作用形成了3个明显的斑点,其中2个斑点的化学位移相近(圈处),由此可知聚合物形成过程中是赖氨酸羰基碳的羧基与ε位的NH2进行了聚合反应,使得羰基碳与近邻的α-碳质子与ε-碳质子的耦合作用强且化学位移相近,而它与β、γ、δ碳质子距离相对较远,耦合作用弱且化学位移相近,结果只形成1个耦合斑点。

图3 纯化产物的长程异核位移相关谱Fig.3 HMBC spectrum of the product produced by Streptomycs sp. GIM8

与上述聚合反应不同时,即聚合过程中赖氨酸的羧基与另一赖氨酸的α-NH2缩合时,羰基碳与2个近邻的α-碳质子具有强耦合作用形成1个明显的斑点,但由于空间结构原因其与β、γ、δ、ε位上的质子耦合作用较弱具位移相近,只形成1个斑点,因此α-赖氨酸的长程异核位移相关谱谱图上只形成2个明显斑点。由上述可知长程异核位移相关谱确证产物为ε-聚赖氨酸。

2.5 Tricine-SDS-PAGE电泳

图4为菌株所合成ε-聚赖氨酸的Tricine-SDS-PAGE电泳图,可以看到所分离的ε-聚赖氨酸分子量约为3300u左右。值得指出的是ε-聚赖氨酸所形成的条带与Marker相比前者更弥散,这可能与ε-聚赖氨酸是链长不一的混合物有关,短链ε-聚赖氨酸电泳时迁移速率较快,而长链分子迁移速率较慢,导致弥散条带形成。此外ε-聚赖氨酸不是一种蛋白分子,它与SDS的结合比例及其在泳道中的迁移规律可能与蛋白分子存在差异,可能也是引起ε-聚赖氨酸条带弥散的原因。

图4 链霉菌GIM8合成ε-聚赖氨酸Tricine-SDS-PFGE电泳图Fig.4 Tricine-SDS-PAGE electrophoresis of the ε-PL produced by Streptomyces sp. GIM8

3 讨论

赖氨酸是人体8种必需氨基酸之一,分子中含有α位及ε位2个不同氨基,因此,赖氨酸聚合物形成过程中赖氨酸分子间有2种明显不同的聚合方式,即:a. 赖氨酸羧基与另一赖氨酸α位氨基缩合,形成常见的蛋白分子α-聚赖氨酸;b. 赖氨酸羧基与另一赖氨酸ε位氨基缩合,形成性质稳定、具有强抑菌活性的异形肽ε-聚赖氨酸。此外,聚合过程中赖氨酸的羧基既与α位氨基又与ε位氨基缩合,则形成不同于α-聚赖氨酸又异于ε-聚赖氨酸的赖氨酸聚合物,不过迄今为止自然界中该类型的聚合物未见报道。综上可知赖氨酸聚合物分子内的键连接方式测定十分必要。

朱宏阳等[29]通过水杨醛与聚合物的游离氨基反应的方法保护氨基,经盐酸水解、薄层色谱后确定聚合物中赖氨酸残基间的键连接方式,不过该方法繁冗,且对人体有一定毒性。本研究采用薄层色谱的方法初步分析ε-聚赖氨酸的化学组成,紫外可见扫描光谱分析有机官能团,长程异核位移相关谱解析键连接方式,3种方法的结合使用是一种适合ε-聚赖氨酸化学组成与结构分析的方法。

ε-聚赖氨酸分子大小与抑菌活性紧密相关,聚合度10以上是其抑菌活性所必需的条件,而9以下则ε-聚赖氨酸完全失去抑菌活性[2],另外一方面ε-聚赖氨酸的苦味随分子量增大而强化,因此在保持抑菌活性的前提下低聚合度ε-聚赖氨酸更符合食品工业的需求[30-31],而高聚合度ε-聚赖氨酸则更适合作为一种生物材料[32]。本研究中的ε-聚赖氨酸产生菌株所合成的ε-聚赖氨酸分子量约为3300,适合作为一种食品防腐剂。

4 结论

薄层色谱及紫外可见扫描光谱可用于ε-聚赖氨酸化学组成及分子结构的初步分析,长程异核位移相关谱可用于解析ε-聚赖氨酸的键连接方式,三者的结合可确证ε-聚赖氨酸的化学组成与结构。

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Analysis of chemical structure and mass weight of a product produced by a suspected ε-poly-l-lysine-producingStreptomycesstrain

LIU Sheng-rong,WU Qing-ping*,ZHANG Ju-mei,MO Shu-ping,YANG Xiao-juan

(Guangdong Institute of Microbiology,Ministry-Guangdong Province Jointly State Key Laboratory of Applied Microbiology,Southern China,Guangzhou 510070,China)

Objective:The aim of this study was to determinate chemical structure and mass weight of a product suspected as ε-poly-l-lysine from aStretomycesstrain.Methods:The chemical composition of the product was determined by thin layer chromatography(TLC);the UV-VIS wavelength scanning was used to analyze organic groups;the chemical bond among l-lysine residues was analyzed by heteronuclear multiple-bond correlation spectrum(HMBC). Tricine-SDS-PAGE was employed for the analysis of molecular weight.Results:The TLC profile indicated that the product consisted of only lysine;the maximum absorbance was observed at 200nm,and almost no absorbance at 260～280nm that characteristics of a protein was detected. The HMBC spectrum confirmed that the product from the strain was ε-poly-l-lysine. The ε-poly-l-lysine had an average mass weight of around 3300u.Conclusion:The product produced by strain GIM8 was ε-poly-l-lysine,and the molecular weight was around 3300u. The combination of the TLC,UV-VIS wavelength scanning,and HMBC can be a suiTableapproach for the determination of the chemical structure of ε-poly-l-lysine.

Streptomyces;ε-poly-l-lysine;chemical structure;HMBC;Tricine-SDS-PAGE

2014-05-29

刘盛荣(1973-)，男，博士，主要从事微生物发酵及代谢调控研究。

*通讯作者:吴清平(1962-)，男，博士，研究员，研究方向：食品安全监测与控制。

广东省科技计划项目(2009B011300004)。

TS202.3

A

:1002-0306(2015)09-0107-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.014