具有近红外荧光的二氧化钛纳米粒的载药与体外释放*

应景艳，徐爱仁，戎建辉，马卫成，何文跃

(浙江省宁波市泌尿肾病医院药剂科，宁波 315100)

具有近红外荧光的二氧化钛纳米粒的载药与体外释放*

应景艳，徐爱仁，戎建辉，马卫成，何文跃

(浙江省宁波市泌尿肾病医院药剂科，宁波 315100)

目的 制备具有近红外荧光的纳米二氧化钛(TiO2)，并考察纳米粒的载药及体外释放性能。方法 通过水热法合成掺杂钐的TiO2(Sm-TiO2)，采用透射电镜(TEM)对其进行表征，测定其荧光光谱，并考察对多柔比星(DOX)的载药量及体外释放曲线。结果 所制备的纳米粒分散均匀，外观呈梭状，长度100～200 nm，发射波长640～670 nm，在水中的载药量达11.5%，体外释放具有pH敏感性。结论 所制备Sm-TiO2有良好的近红外荧光发光效果、较高的载药量及可控的体外释放，可以作为新型药物载体深入研究。

二氧化钛(TiO2)；药物载体；释放，pH敏感；近红外荧光

肿瘤是危害人类生命健康的主要疾病之一，其治疗一直是医药研究领域的难题。尽管新型纳米给药系统，如胶束、脂质体、纳米粒、树状大分子等的出现在一定程度上改善治疗效果，但仍存在体内过程难以实时监测等问题。近年来，随着纳米技术的发展及活体成像技术的出现，使载体的体内过程监控成为可能。活体成像技术是指利用灵敏的光学检测仪器，直接监测活体生物体内具有荧光的细胞活动和基因行为的技术。通过此项技术，可以直观的观测特定基因的表达、肿瘤的生长及转移等生物学过程。其对光的波长有一定要求，波长在650～950 nm及1 050～1 300 nm范围内的光具有较好的组织穿透能力，有利于活体成像[1]。二氧化钛(TiO2)作为一种新型功能纳米材料，具有良好的生物相容性，通过稀土离子掺杂后在近红外区具有荧光效应，可用于活体成像，此外其还具有较高的表面积(300 m2·g-1)[2]，可负载大量的药物；同时由于其具有超声敏化功能，在超声作用下产生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，从而可以杀伤肿瘤细胞[3-4]。因此笔者拟构建稀土离子掺杂的纳米二氧化钛，并以其作为药物载体，实现药物定向传输。

1 材料与方法

1.1 药品与试药 四氯化钛(TiCl4，批号：20130315)、氨水(批号：T20100118)均为分析纯(国药化学试剂有限公司)；六水合硝酸钐(SmN3O9·6H2O，阿拉丁试剂有限公司，批号：37198，)；盐酸多柔比星(DOX，北京华奉联博科技有限公司，批号：HF100519，含量>98.0%)；盐酸多柔比星对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130509-200301，含量99.5%)；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 JEM-1200EX透射电子显微镜(日本JEOL公司)；FP 6500荧光分光光度仪(日本JASCO公司)；TU-1800PC紫外-可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限公司)；TGL-168高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；SRJX箱式电炉(上海锦屏仪器仪表有限公司)。

1.3 钐掺杂TiO2(Sm-TiO2)的制备 通过TiCl4水解的方法制备纳米粒。称取SmN3O9·6H2O 0.06 g溶于去离子水100 mL中，待完全溶解后，快速搅拌下加入TiCl42 mL，继续搅拌10 min，生成纳米TiO2前驱体，搅拌下加入氨水调节pH至9.3，继续搅拌30 min，离心洗涤数次后，转移至内衬聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中进行水热反应，220 ℃反应3 h后，自然冷却至室温，取出后洗涤3次，60 ℃干燥，然后转移至马弗炉中350 ℃煅烧2 h。所得产物形态利用透射电镜(transmission electron microscope，TEM)进行观察，荧光光谱利用荧光分光光度计在365 nm激发光下测定。

1.4 DOX标准曲线的制备 取DOX对照品，配制2，5，10，20，50，100 μg·mL-1的溶液，分别在488 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。由曲线得到浓度与吸光度的函数方程为C=57.958A-0.230 5，其中C为DOX溶液的浓度(μg·mL-1)，A为488 nm波长条件下所测得的吸光度，拟合优度r=0.999 6，说明DOX在2～100 μg·mL-1范围内具有良好线性关系。

1.5 DOX的负载 将一定浓度的 DOX与0.4 mg·mL-1的Sm-TiO2在pH 5.0，6.5，7.4磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)及水中搅拌过夜，然后9 600×g离心10 min去除未结合的DOX，所得物用PBS洗涤数遍，直到上清液完全无色，所得物(标记为DOX -TiO2)重悬后4 ℃ 保存。上清液合并收集，用紫外分光光度仪488 nm波长测定吸光度，根据标准曲线计算载药量。

1.6 DOX -TiO2纳米粒的体外释放研究 精密称取DOX -TiO2纳米粒适量，分别分散于pH 5.0，6.5，7.4介质中，配置成1 mg·mL-1溶液，在37 ℃下恒温振荡(100 r·min-1)进行体外释放考察，分别在1，2，4，6，8，10，20 h时间点取样，9 600×g离心10 min，取出上清液，同时补充新鲜释放介质，上清液于488 nm波长测定吸光度计算释放百分率。

2 结果

2.1 Sm-TiO2的形貌表征 利用TEM对Sm-TiO2纳米粒的形态进行表征，Sm-TiO2外观呈类梭状，分散良好，无明显团聚现象(图1)，其长度为100～200 nm，宽度为30～50 nm，载药后，Sm-TiO2纳米粒形态未发生明显变化。利用荧光分光光度计测定Sm-TiO2纳米粒的荧光光谱(图2)，结果显示纳米粒在590～620 nm及640～670 nm均有明显荧光，所发出的荧光具有良好的强度，肉眼可见(图3)，且载药对其荧光强度无明显影响。

Fig.1 Transmission electron microscopy(TEM)image of Sm-TiO2

2.2 DOX的负载 结果见图4。随着pH的增加，在相同DOX浓度条件下，TiO2的载药量显著增加。同时DOX在水中仍具有良好的负载性能，载药量达到11.5%。由于DOX在水中较易溶解，因此以水作为负载介质。DOX浓度对载药量的影响结果见图5。随着药物浓度的增加，载药量呈非线性增加，当DOX浓度超过100 μmol·L-1时，载药量增加缓慢，因此可以选择100 μmol·L-1作为负载浓度。载药后，由于DOX的吸附，TiO2纳米粒由白色转变为红色(图6)，高速离心(10 000 r·min-1，10 min)后，DOX-TiO2聚集到离心管底部，上清液呈无色透明，说明DOX完全吸附到纳米粒表面。

图3 Sm-TiO2在白光及紫外激发下的荧光照片

Fig.3 Fluorescence photograph of Sm-TiO2under white light and UV

2.3 DOX的释放 DOX-TiO2在不同pH条件下随时间变化的体外释放结果见图7。从图7可以看出，药物释放的快慢与介质的pH有关，随着pH的降低，药物释放加快，在pH5.0介质中，20 h累积释放接近70%，这主要与DOX在酸性条件下溶解度较好有关。

3 讨论

本研究运用水热法合成稀土掺杂的Sm-TiO2，得到分散良好、长度为100～200 nm的梭状纳米粒，并利用荧光分光光度计对该纳米粒的荧光光谱进行测定，结果显示波长在590～620 nm及640～670 nm均有明显荧光。波长大于650 nm的光具有良好的组织穿透性，因此Sm掺杂的TiO2纳米粒在生物成像方面具有一定的应用前景。

Fig.4 Drug loading capacity of DOX in water and PBS with different pH

Fig.5 Effect of different concentration of DOX on its drug loading capacity

图7 在不同pH缓冲液中DOX从DOX-TiO2的释放曲线

Fig.7 Release curve of DOX from DOX-TiO2in buffers at different pH values

本实验中，随着pH的增加，在相同DOX浓度条件下，TiO2的载药量显著增加，这主要是由于DOX在酸性条件下溶解度较高，当pH降低时DOX以解离状态存在，DOX与TiO2之间的疏水作用力减弱，因此载药量降低，当pH较高时，DOX疏水性增加，其与TiO2之间的疏水作用力随之增加，因此载药量增加[5-6]。

体外释放结果表明介质的pH对DOX-TiO2的体外释放具有明显影响，pH越低药物释放越快。人体正常微环境的pH约为7，而大多数癌细胞组织外、细胞内溶酶体等的微环境是酸性的，有利于DOX的释放，因此，有很多pH依赖性释放的报道，以达到药物在靶部位定向释放的目的。如SHEN等[7]利用聚电解质胶囊负载DOX，通过pH控制药物释放；XIE等[8]将DOX负载与介孔二氧化硅，并通过调节pH控制药物释放速率。这种pH敏感释放特性能够促进药物在肿瘤低pH环境下释放，从而发挥更好地肿瘤抑制作用。

本研究制备的纳米粒同时具有成像和载药双重性能，静脉注射进入体内后，可通过荧光观察其体内分布情况，以便了解载体对肿瘤的靶向性，同时载体在肿瘤部位可实现pH敏感释放，将有利于肿瘤的治疗。目前，将载体同时应用于成像及药物传递的研究已有较多报道，如NaYF4[9]、CdSe[10]等，但以TiO2作为成像及载体的研究相对较少。此外，由于TiO2具有良好的光催化及超声催化性能，因此进一步探讨载药纳米粒的催化治疗与化疗联合应用，对该载体在抗肿瘤方面研究具有重要意义。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.025

Drug Loading and Release of Titanium Dioxide Nanoparticles with Near-infrared Light

YING Jingyan, XU Airen, RONG Jianhui, MA Weicheng, HE Wenyue

(DepartmentofPharmacy,RenopathyandUrologyHospitalofNingboCity,ZhejiangProvince,Ningbo315100,China)

Objective To prepare titanium dioxide (TiO2) nanoparticles with good near-infrared light and study the loading and release of doxorubicin. Methods The Sm doped TiO2nanoparticles (Sm-TiO2) were synthesized using a modified solvothermal reaction and then observed with transmission electron microscope.The fluorescence spectrum, doxorubicin loading capacity and release profile were also determined. Results The obtained Sm-TiO2nanoparticles with the length from 100-200 nm were fusiform and well dispersed.The emission wavelength was 640-670 nm.The drug loading capacity in water was 11.5%.DOXinvitrowas pH sensitive to release. Conclusion Sm-TiO2nanoparticles have good near-infrared light, high drug loading capacity and controllable drug release are obtained and should be studied further more as a novel carrier.

Titanium dioxide (TiO2)； Drug carrier； Release, pH sensitivity； Near-infrared light

2014-02-24

2014-09-14

*宁波市自然科学基金资助项目(2012A610182)

应景艳(1983-)，女，浙江宁波人，主管药师，硕士，从事临床药学工作。电话：0574-83039130，E-mail：ffxfly@163.com。

何文跃(1971-)，男，浙江舟山人，副主任药师，主要从事药物新制剂研究。电话：0574-83039130，E-mail：hwy710331@sina.com。

R945

B

1004-0781(2015)06-0795-04