高效液相色谱法测定板蓝根颗粒中(R，S)-告依春的含量*

巩伟，刘忠良，赵庆华，文凤娥，李鹏，张琨，赵梅

(济南军区联勤部药品仪器检验所，济南 250022)

高效液相色谱法测定板蓝根颗粒中(R，S)-告依春的含量*

巩伟，刘忠良，赵庆华，文凤娥，李鹏，张琨，赵梅

(济南军区联勤部药品仪器检验所，济南 250022)

目的 建立高效液相色谱(HPLC)法测定板蓝根颗粒中(R，S)-告依春的含量并讨论含量限度。方法 色谱柱为SHIMADZU VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.02%磷酸溶液(7：93)，流速1.0 mL·min-1，检测波长为245 nm，自动进样器进样，进样量10 μL。分别依照转移率、测定结果统计数据讨论含量限度。结果 (R，S)-告依春在0.058 7～150.349 5 μg·mL-1质量浓度范围内线性关系良好(r=0.999 7，n=7)，低、中、高加入量平均回收率分别为98.72%，98.40%，98.60%，RSD分别为1.84%，0.50%，1.82%。依照转移率、测定结果统计数据确定含量限度存在问题。结论 该法操作方便、结果准确，精密度好，专属性强，可用于板蓝根颗粒的质量控制；(R，S)-告依春的含量限度应依据药动学和药效学数据确定。

板蓝根颗粒；(R，S)-告依春；含量限度；色谱法，高效液相

板蓝根颗粒具有清热解毒、凉血利咽功效，其现行法定质量标准为《中华人民共和国药典》2010年版第二增补本[1]，检验项目包括鉴别、检查等，无含量测定。研究表明，板蓝根抗病毒作用的代表性物质基础为(R，S)-告依春[2-4]。目前，通过测定(R，S)-告依春的含量从而对板蓝根及其制剂进行质量控制业已得到广泛研究和报道[5-13]。我部连续4年对军队医疗机构使用的板蓝根颗粒进行评价性抽验，共抽验89个生产企业的板蓝根颗粒584批次，基本摸清板蓝根颗粒的质量现状。在评价性抽验基础上，参考《中华人民共和国药典》和文献报道，建立高效液相色谱(highperformance liquid chromatography，HPLC)法测定板蓝根颗粒中(R，S)-告依春含量的方法，并测定其中66个厂家241批次板蓝根颗粒的(R，S)-告依春含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪(带SPD-M10Avp二极管阵列检测器，SIL-20A自动进样器，日本岛津公司)；AUW220D电子分析天平(日本岛津公司)；AS-3120A超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；Synergy-UV超纯水器(法国Millipore公司)。

1.2 试药 (R，S)-告依春对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号：111753-201304，含量测定以99.9%计算)；甲醇为色谱纯，水为自制超纯水，其他试剂均为分析纯。板蓝根颗粒来源于66个厂家共241批次，规格：每袋10，5和3 g，其中3 g为无蔗糖型。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性实验 SHIMADZU VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.02%磷酸溶液(7：93)，流速1.0 mL·min-1；检测波长：245 nm；自动进样器进样，进样量10 μL；理论板数按(R，S)-告依春峰计应不低于5 000。色谱图见图1。

A.对照品溶液；B 供试品溶液；1.(R，S)-告依春

图1 对照品溶液和供试品溶液高效液相色谱图

A.control solution；B.sample solution；1.(R，S)-epigoitrin

Fig.1 HPLC chromatograms of control and sample solution

2.2 供试品溶液和对照品溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物适量，混匀，研细，取约2.0 g(含蔗糖)或1.0 g(无蔗糖)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20 mL，称定质量，水浴加热并振摇使溶解，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 取(R，S)-告依春对照品适量，精密称定，置50 mL量瓶中，加水制成每毫升含150.35 μg的对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液适量，加水制成不同浓度的对照品溶液，最终浓度分别为0.058 7，0.234 9，0.939 7，3.758 7，15.035 0，60.139 8，150.349 5 μg·mL-1。

2.3 线性关系考察 取“2.2.2”项7个对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得(R，S)-告依春的回归方程为Y=75 672X+6 756(r=0.999 7，n=7)。实验结果表明，(R，S)-告依春在0.058 7～150.349 5 μg·mL-1浓度范围内与峰面积线性关系良好。设定液相色谱仪QA/QC参数，调整信噪比(S/N)为10：1，得定量限为9.78×10-3μg·mL-1；调整信噪比(S/N)为3：1，得检测限为2.45×10-3μg·mL-1。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验 精密吸取同一浓度的(R，S)-告依春对照品溶液(3.758 7 μg·mL-1)，连续进样6次，(R，S)-告依春峰峰面积的RSD为0.35%，表明精密度良好。

2.4.2 重复性实验 取同一批检品(批号：H2F009)6份，按“2.2.1”项下方法制备，测得(R，S)-告依春的平均含量为0.052 1 mg·g-1，RSD为0.45%，表明该方法重复性好。

2.4.3 稳定性实验 取同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，16和24 h进样分析，测得(R，S)-告依春峰峰面积的RSD为1.43%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.4.4 加样回收实验 取已知含量的检品(广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：H2F009)9份，每份约1.0 g，精密称定，分别按已知含量的50%，100%和150%加入(R，S)-告依春对照品，按“2.2.1”项制备，进行加样回收实验，结果见表1。

表1 (R，S)-告依春加样回收实验结果

Tab.1 Results of recovery tests of(R，S)-eprgoitrin

2.5 样品含量测定 按照上述方法，对其中66家生产企业的241批次检品进行含量测定。先按生产企业，同一企业再按检品规格对含量测定结果进行统计处理，并以平均含量表示其结果。见表2。

3 讨论

选择测定波长时，参照《中华人民共和国药典》2010 年版一部板蓝根项下规定，测定波长为245 nm。同时，以二极管阵列检测器扫描供试品溶液，发现(245±2)nm处吸收度最大，故选取245 nm作为测定波长。

选择流动相时，对比考察甲醇-0.02%磷酸溶液(7：93)、甲醇-0.5%磷酸溶液(8：92)、乙腈-0.2%二乙胺溶液(10：90)等3种流动相，结果表明，以甲醇-0.02%磷酸溶液(7：93)为流动相时响应值好，峰形良好，理论板数、分离度等符合要求。

本实验选用不同品牌的色谱柱进行比较：SHIMADZU VP-ODS色谱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX Extend C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil KR100-5-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)以及Inertsil ODS3(250 mm×4.6 mm，5 μm)。结果显示，4种色谱柱的响应均良好，峰形均良好。本实验仅选择其中的SHIMADZU VP-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱进行方法学考察和样品含量测定。

在提取溶剂的选择上，(R，S)-告依春为水溶性成分，故直接用水对样品进行稀释处理，操作方便，经济节省，对环境无污染。

由表2可知，抽检2批次及以上的企业内部各批次的RSD均小于3%，表明各企业内部各批次的(R，S)-告依春含量差异均较小，测定结果稳定可靠。各生产企业之间的平均含量差异则较大：最高者为每袋2.879 6 mg，最低者则为未检出(测定值低于定量限，判为未检出)。各生产企业检品的含量差异如此之大，可能与选用的板蓝根饮片原料来源不同以及制备工艺差异有关。

目前，尚未有文献报道板蓝根颗粒中(R，S)-告依春的含量限度。《中华人民共和国药典》2010年版一部“板蓝根”项下规定，饮片含(R，S)-告依春不得少于0.030%。板蓝根颗粒有4种规格，其中每袋10 g相当于饮片14 g，每袋5，3，1 g均相当于饮片7 g。按转移率100%计算，可得10 g的限度为4.2 mg，其他规格限度为2.1 mg。但以上仅为理论折算，实验测得检品中的含量远低于此。10 g和5 g规格为含糖型颗粒，而3 g规格为无糖型颗粒，测定结果未发现3种规格的含量差异无统计学意义，这说明颗粒剂中有无蔗糖对含量测定结果无显著性影响。

本次抽验中，10 g规格的检品有201批次，经计算，(R，S)-告依春每袋平均含量为0.466 0 mg。假定以平均含量的20%为限度参考值，其数值为0.093 2 mg，取整为0.10 mg。参照此限度值，10 g规格的检品中，有50个厂家共186批次的样品合格，合格率为92.54%。根据处方，取规格5，3和1 g含量限度值为10 g的一半，为每袋0.050 mg，即每袋50 μg，以此为限度，本次测定的该2种规格的检品全部合格。上述限度值仅是根据此次实验数据统计结果进行的人为假定，其合理性仍有待于进一步的研究确认。

制定有效成分含量限度要考虑到制备提取工艺、转移率等多种因素的影响[14-17]，其中药效学和药动学数据是重要的参考依据。文献报道，基于流感病毒神经氨酸酶(neuramidinase，NA)抑制活性评价的(R，S)-告依春抗病毒作用的最低有效含量点为82.5 μg·mL-1[18]。假定最低有效含量即最低血药浓度，取表观分布容积为4.3 L，体质量为60 kg，不考虑药动学等因素，则一日最低有效剂量为82.5×4.3×1 000/(1 000×60)=5.912 5 mg·kg-1。用量按每次2袋，每天4次计算，则每袋最低含量应为5.912 5×60/8=44.34 mg，即每袋板蓝根颗粒中(R，S)-告依春的最低含量应为44.34 mg。以此为限度，本次测定的检品全部不合格。诚然，上述的计算是否合理，需要更详实的药效学和药动学数据的支持，但以上计算表明，板蓝根的抗病毒作用应为多种成分共同作用的结果，而不仅仅是(R，S)-告依春起作用。基于抗病毒活性检测的板蓝根质量生物平均方法证实这一点[19-21]。研究表明，板蓝根对NA的抑制活性IC50=(0.90±0.20) mg·mL-1(生药)，相对于(R，S)-告依春的最低有效浓度(82.5 μg·mL-1)，其比值约为1：11，远大于板蓝根中(R，S)-告依春的百分含量值(最低为0.030%)。这表明，板蓝根颗粒中其他成分的存在对(R，S)-告依春的抗病毒作用的发挥产生影响，只是这些成分在其中所起的作用与药效作用的关联度不同，从而共同发挥抗病毒作用。因此，对于(R，S)-告依春的含量限度，仍需要进一步的药效学、药动学以及临床实验等数据资料的支持。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.024

Determination of (R,S)- Epigoitrin inBanlangenGranules by HPLC

GONG Wei, LIU Zhongliang, ZHAO Qinghua, WEN Fenge, LI Peng,ZHANG Kun, ZHAO Mei

(InstituteforDrugandInstrumentControl,JointLogisticsDepartmentofJinanMilitaryCommand,Ji’nan250022,China)

Objective To establish HPLC method for determination of (R,S)-epigoitrin inBanlangengranules and discuss the content limitation. Methods The samples were separated on SHIMADZU VP-ODS (150 mm×4.6 mm, 5 μm) and the mobile phase consisted of methol-0.02% phosphoric acid solution (7：93) at a flow rate of 1.0 mL.min-1.The detection wavelength was set at 245 nm and the injection volume (in automatic sampler) was 10 μL.The content limitation was assessed according to the transfer rate and statistical data of the results. Results (R,S)-epigoitrin showed a good linear relationship at concentration of 0.058 7-150.349 5 μg·mL-1(r=0.999 7,n=7).The average recovery rate was 98.72%, 98.40% and 98.60%, respectively； RSD was 1.84%, 0.50% and 1.82%, respectively.The content limitation of (R,S)-epigoitrin was unreasonable according to the transfer rate and the statistical data of the results. Conclusion The method is easy and simple to operate, accurate and stable in results, and highly specific, thus it is applicable for the quality control of Banlangen granules.The content limitation should be determined on the basis of pharmacokinetic and pharmacodynamic data.

Banlangen Granules； (R,S)-epigoitrin；Content limitation； Chromatography,high performance liquid

2014-03-04

2014-07-17

*济南军区后勤科研计划项目(CJN12L078)

巩伟(1980-)，男，山东新泰人，主管药师，博士，研究方向：药品质量分析。电话：0531-51637775，E-mail：gongweicn@foxmail.com。

R927.2；R284.1

B

1004-0781(2015)06-0791-05