解郁育胞方对慢性应激大鼠子宫内膜容受性的影响

耿会转，贺漪，周顺长,韦文双，方鸿浩，黎烈荣

(1.湖北中医药大学，武汉 430061；2.武汉市第一医院妇产科，武汉 430022；3.华中科技大学同济医学院实验动物中心，武汉 430030)

解郁育胞方对慢性应激大鼠子宫内膜容受性的影响

耿会转1，贺漪2，周顺长3,韦文双1，方鸿浩1，黎烈荣1

(1.湖北中医药大学，武汉 430061；2.武汉市第一医院妇产科，武汉 430022；3.华中科技大学同济医学院实验动物中心，武汉 430030)

目的 研究解郁育胞方对慢性应激大鼠的子宫内膜胞饮突、HOXa-10 mRNA的影响，探讨其对慢性应激大鼠子宫内膜容受性的调节机制。方法 SPF级SD大鼠48只，按体质量分层随机分为3组：正常对照组、模型对照组、实验药物组。模型对照组、实验药物组大鼠建立慢性应激模型。实验药物组于刺激第1天开始，每日9:00给予解郁育胞方溶液(相当于生药1 g ·mL-1)灌胃，给药容量为11.8 mL·kg-1,每日1次，至经阴道涂片检查确认妊娠后第4天停药。正常对照组、模型对照组每日9：00灌服纯化水11.8 mL·kg-1。3组大鼠分别于第21天16:00按照雌：雄=2：1合笼,确认妊娠后第4天处死大鼠，透射电镜制片评价子宫内膜胞饮突的成熟度，实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测HOXa-10 mRNA含量。结果 胞饮突成熟度：正常对照组评分(2.7±0.3)分，模型对照组组评分(1.3±0.3)分，实验药物组评分(2.1±0.2)分，实验药物组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。HOXa-10 mRNA的表达：模型对照组HOXa-10 mRNA水平(0.658±0.031)较正常对照组(0.965±0.102)显著下降(P<0.05)，实验药物组(0.866±0.125),与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 解郁育胞方可能通过促进子宫内膜上皮细胞HOXa-10 mRNA的表达增强，从而使胞饮突的数量和成熟度增加，进而改善子宫内膜的容受性。

解郁育胞方；应激，慢性；子宫内膜；容受性

子宫内膜容受性是指子宫对胚胎定位、黏附、侵入子宫内膜的接受能力。子宫内膜容受性差导致胚泡着床率低是不孕的重要原因。现代生殖技术体外受精-胚胎移植(invitrofertilization and embryo transplantation,IVF-ET,俗称试管婴儿)通过改良促排卵方案、优化实验室手段或移植前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)等技术，已经能够获得优质胚胎，但胚胎的着床率低成为制约助孕技术发展的瓶颈。临床可通过使用激素调节内膜厚度[1]，应用小剂量阿司匹林增加子宫血流供应[2]等方式改善内膜容受性，以提高临床妊娠率；也有中医药研究结果表明，通过补肾健脾活血[3-4]等能够改善内膜容受性。近年来人们逐渐认识到心理因素可能对子宫内膜容受性有影响，推测负性心理应激影响子宫内膜容受性是导致不孕的重要原因[5]。然而，通过改善患者机体心理应激状态提高子宫内膜容受性的研究鲜见。解郁育胞方是我院妇科验方，由《傅青主女科》开郁种玉汤化裁，独辟蹊径，从疏肝养肝的角度，改善不孕患者情志对子宫内膜容受性的影响，提高临床妊娠率。笔者在本研究中建立慢性应激大鼠模型，从实验角度进一步探索解郁育胞方对慢性应激大鼠子宫内膜容受性的影响，阐明其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级未孕斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)雌性大鼠，连续1周做阴道脱落细胞涂片观察，选择有正常动情周期者48只纳入实验，8周龄，体质量(200±10)g；雄性健康性成熟SD大鼠24只，SPF级，体质量(200±10)g，均由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2008-0005，动物合格证号:42000600003755。所有大鼠购入后无菌程序转入华中科技大学实验动物中心SPF级屏障系统动物实验室，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2010-0057；湖北省实验动物设施使用证明号：NO.00126877。动物实验环境维持温度20～24 ℃，相对湿度40%～60%，噪声<60 dB，自由饮用无菌水，进食经121 ℃、15 min灭菌的全价营养颗粒饲料(湖北万千佳兴实验动物有限公司提供)。

1.2 药物与试剂 解郁育胞方方药组成：白芍15 g(批号：1403139)，当归12 g(批号：1402123)，白术12 g(批号：1403081)，茯苓15 g(批号：1402007)，熟地20 g(批号：1402119)，山药20 g(批号：1401360)，酒萸肉15 g(批号：1403014)，醋香附10 g(批号：1402005)，玫瑰花6 g(批号：1312027)。所有药物均为免煎颗粒，由江阴天江药业有限公司提供。2份解郁膏胞方颗粒加双蒸水配成250 mL混悬溶液备用(相当于生药1 g·mL-1)，放入冰箱4 ℃保存。双蒸水(广州复能基因有限公司，批号：C1D230A)。Trizol-RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，批号：008065yjj)，DL2000 DNA Marker试剂盒(日本Takara公司，批号：M2505)，5×反转录酶缓冲液及M-MLV(广州复能基因有限公司，批号：CO2010A)，Oligo(dT)、β-Actin引物(金斯瑞生物科技有限公司合成引物)，SYBR Green/Flour escein qPCR Master Mix(2X)试剂盒(美国ABI公司，批号：#D01010A)。

1.3 主要仪器 JY300水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)，分光光度计(上海舜宇恒科学仪器有限公司),Viia7实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，透射电镜(日本Hatachi公司)。

1.4 动物造模 采用文献[6-7]所述方法制作慢性心理应激大鼠模型。接受应激处理的组别大鼠置于独立房间，接受21 d 不同的应激原刺激，包括行动受限(2 h)、夹尾(1 min,tid)、冰水游泳(4 ℃,5 min)、噪音(75 dB，1 h)、禁食(24 h)、禁水(24 h)。每周一至周六依次安排 1 种刺激，周日不给予任何刺激。大鼠出现神情倦怠，体质量增加缓慢，进食兴趣降低，修饰行为(抬举、抓痒、舔足等)减少，提示造模成功。

1.5 分组与给药 将大鼠按照体质量分层随机分为3组，每组16只。正常对照组(无应激，无灌药)，模型对照组只有应激，实验药物组(应激+灌解郁育胞方药液)。实验药物组于应激第1天开始，每日9：00给予解郁育胞方溶液灌胃，按体表面积折算临床有效剂量[8]，剂量为相当于生药11.8 g·kg-1,转化为混悬药液11.8 mL·kg-1，每日1次，至处死。正常对照组、模型对照组每日9：00灌服等体积纯化水11.8 mL·kg-1，每日1次，直至处死。

3组大鼠分别于第21天16：00雌雄2：1合笼,次日晨9：00时检查阴栓,并经过阴道涂片检查，发现精子或阴栓者记为妊娠第1天。

1.6 标本采集 各组分别于妊娠后第4天处死大鼠，剖取并分离子宫，将子宫内膜沿纵轴剖开，展平，反复用0.9%氯化钠溶液冲洗后，取单侧子宫置于4%戊二醛中固定24 h，制成透射电镜标本。取另侧子宫取出后立即置于-80 ℃冰箱保存，实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time polymerase chain reaction，Real-Time PCR)测HOXa-10 mRNA含量。

1.7 指标检测

1.7.1 子宫内膜胞饮突的表达 取子宫组织(含内膜组织)，浸入0.9%氯化钠溶液中超声清洗5～10 min，置于4%戊二醛中固定24 h，再浸入1%锇酸后固定2 h。然后浸入系列丙酮液中梯度脱水10 min,置入2%醋酸异戊酯中置换3 h，临界点干燥,装台粘胶,涂银粉导电胶,用真空镀膜仪对样本进行金属镀膜,电镜下观察、获取图片以观察子宫内膜胞饮突。按REBECCA[9]方法,每个样品选取12个视野观察胞饮突,根据胞饮突的范围进行评分, 0分:无胞饮突； 1分:<25%； 2分:25%～50%；3分:>50%,然后对评分进行统计学分析。

1.7.2 Real-Time PCR技术检测大鼠子宫内膜 HOXa-10mRNA表达

1.7.2.1 RNA提取和cDNA合成 将-80 ℃冻存标本于4 ℃融化,用trizol试剂提取RNA,具体步骤按说明书操作,总RNA含量用分光光度计检测。cDNA通过反转录反应合成,每3 μgRNA需Oligo(dT)2 μL,加双蒸水至14.5 μL，70 ℃ 反应5 min,短暂离心后置于冰上。然后将其加入5×反转录酶缓冲液4 μL， RNA酶抑制剂0.5 μL，M-MLV 1 μL，加双蒸水至20 μL，42 ℃ 反应60 min，95 ℃反应 5 min合成cDNA。

1.7.2.2 引物和探针 HOXa-10基因应用BBI库设计引物序列，擎科生物合成引物。大鼠HOXa-10,正义: 5′- GAGAATACGCCATTGAGCCC -3′,反义: 5′-TGCCCACCGTGCTATAGAAA-3′。β-Actin引物作为内对照。β-Actin ,F：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTC-ATC-3′,R：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。

1.7.2.3 实时荧光定量PCR 采用SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)试剂盒，根据说明书，用实时荧光定量PCR仪扩增cDNA。主要内容包括：A.用β-Actin绘制标准曲线(稀释倍数为×1,×0.25,×0.0625,×0.0156,×0.003 91)；B.标本mRNA含量的测定通过计算标本的mRNA与β-Actin mRNA的比值来确定；C.用TAE电泳缓冲液配置 2.0%琼脂糖凝胶，以 120 V恒压电泳约15 min后在凝胶成像仪下分析结果。

2 结果

2.1 大鼠子宫内膜胞饮突表达 采用透射电镜以及REBECCA方法评分评价子宫内膜胞饮突成熟度。正常对照组子宫内膜上皮细胞膜表面有大量“蘑菇状”突起,界限清楚，无微绒毛，表现为完全发育的胞饮突；胞饮突评分(2.7±0.3)分。模型对照组子宫内膜表面形态不均一,少量胞饮突局灶性表达,大部分内膜表面无膜状突起,覆以浓密的微绒毛；胞饮突评分(1.3±0.3)分。实验药物组子宫内膜表面表达大量胞饮突,仍有少量短而细的微绒毛,发育较正常对照组略延后；胞饮突评分(2.1±0.2)分。与正常对照组比较，模型对照组胞饮突评分显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，实验药物组胞饮突评分明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 子宫内膜HOXa-10的表达 采用实时荧光定量PCR技术检测大鼠子宫内膜 HOXa-10基因表达，大鼠子宫内膜HOXa-10 mRNA电泳结果显示，3组在250 bp处均出现了特异性HOXa -10 mRNA 基因条带(图2)。HOXa-10 mRNA含量通过计算标本的mRNA与β-Actin mRNA的比值测定，HOXa-10 mRNA在3组子宫内膜和蜕膜组织中均有表达，正常对照组为(0.965±0.102)，模型对照组为(0.658±0.031)，实验药物组为(0.866±0.125)。与正常对照组比较，模型对照组HOXa-10 mRNA表达水平显著下降(P<0.05)，而实验药物组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 3组子宫内膜 HOXa-10 基因的 RT-RNA 凝胶电泳图

A.normal control group；B.model control group；C.experimental drug group

Fig.2 RT-RNA gel electrophoresis of HOXa-10 in three groups of endometrium

3 讨论

子宫内膜允许胚胎着床的关键时期,称为“植入窗期”，代表子宫内膜容受性达到最高[4]。人类此期通常在受精后5～7 d,持续不超过48 h；在大鼠、小鼠等啮齿类动物,植入窗在受精后4 d开放,持续约24 h[10]。本研究通过了解解郁育胞方对慢性应激大鼠植入窗期子宫内膜胞饮突以及HOXα-10 mRNA的表达，了解对子宫内膜容受性的影响。

植入窗期间子宫内膜上皮细胞表面的微绒毛被一种形态较大、足状或蘑菇状的突起取代,这种膜性突起因其具有胞饮功能而被称为“胞饮突”。胞饮突使宫腔体积减小,有助于胚胎在子宫内膜的定位，防止上皮细胞表面对胚胎的清除；增加黏附过程中内膜上皮细胞和胚胎滋养外胚层细胞的接触面,帮助胚胎与子宫上皮表面更接近，介导上皮细胞对液体和大分子物质的摄入。完全发育的胞饮突是子宫内膜容受性建立和植入窗开放的重要形态学标志。根据REBECCA方法评分，与正常对照组相比，模型对照组胞饮突评分显著降低，而实验药物组评分与正常对照组相比差异无统计学意义，说明解郁育胞方能显著改善慢性应激大鼠的胞饮突成熟度。

HOXa-10 基因在人类主要表达于子宫内膜，对子宫内膜的增殖和分化、胞饮突和微绒毛的形成、胚胎的着床和发育等有重要调控作用[11]。许多学者将 HOXa-10基因的表达作为衡量子宫内膜容受性的分子标志物。研究表明，改变成熟雌鼠子宫HOXa-10的表达,用电镜检测在着床期的子宫形态学改变,发现上皮细胞胞饮突的数量和成熟度与HOXa-10的表达呈正相关, HOXa-10是胞饮突形成的关键因素[12]。

患者一旦被确诊为不孕，长期的心理紧张，导致出现焦虑、抑郁、敏感、处事偏激、负罪感、人际关系孤独等各种负性心理情绪，使机体处于慢性应激状态，出现睡眠和食欲差、性关系冷淡等，有13%患者表现出抑郁相关症状[13]。KLONOFF-COBEN等[14]对151例施行IVF 和输卵管内配子移植技术的患者进行心理方面的调查研究，发现心理因素可影响包括取卵、移植、临床妊娠等各个方面。情绪的改变常导致内分泌紊乱，血浆中激素水平和神经递质出现变化。本研究中慢性应激模型对照组的胞饮突成熟度不足及数量减少，HOXa-10基因表达较正常对照组降低。推测负性心理应激通过下调子宫容受性来影响受孕，导致胚胎移植的失败率升高。

中医学中，慢性应激属于肝郁范畴。女子素性忧郁，复因久不受孕，七情内伤，继发肝气不舒，气机不畅，冲任不能相资，不能摄精成孕。又肝郁克脾，脾伤不能通任脉而达带脉，任带失调，胎孕不受。解郁育胞方以《傅青主女科》开郁种玉汤化裁，禀疏肝养肝，健脾益精为大法，肝、脾、肾三脏同治，疏中有养，补中寓通，行气而不伤正，养精而不滞血。方中当归、白芍均为肝经要药，前者辛散，疏达肝之气血；后者酸柔，补敛肝之阴血，一动一静，疏肝养肝，共为君药。香附、玫瑰花疏肝解郁为臣。白术、茯苓健脾益气，非但实土以抑木，且使营血生化有源；熟地、山茱萸益肾填精，滋阴养血，均为佐使。诸药合用，相得益彰，共使肝郁得疏，血虚得养，脾弱得复，肾精得濡，而胎孕乃成。

本研究结果发现，使用解郁育胞方干预后，慢性应激大鼠在植入窗期的上皮细胞胞饮突数量和成熟度明显升高，HOXa-10 mRNA的表达增强，且胞饮突的数量和成熟度与HOXa-10基因的表达呈正相关，这与CAKMAK等[12]研究结果相符；笔者推断，解郁育胞方通过上调子宫内膜上皮细胞HOXa-10基因的表达，从而调控着胞饮突的成熟，这可能是解郁育胞方改善子宫内膜容受性的机制之一。另外，由于实验条件所限，本研究未能全面了解大鼠子宫内膜容受性的其他细胞因子的表达及调控情况，还可以通过测定组织学如子宫内膜厚度以及血流的影响，以及最佳药物剂量和药物毒性实验等将在以后的工作中开展进一步研究。

[1] GORKEMLI H，AK D，AKYUREK C，et al.Comparison of pregnancy outcomes of progesterone or progesterone + estradiol for luteal phase support in ICSI-ET cycles[J].Gynecol Obstet Invest，2004，58(3):140-144.

[2] 彭莲红，欧阳瑞霞，易清.阿司匹林对氯米芬诱导排卵患者子宫内膜容受性的影响[J].山东医药，2008，48(16):38.

[3] 孙振高，连方，李婷婷，等.补肾中药对超排卵周期子宫内膜容受性影响的超声学评价[J].中国超声医学杂志，2011，27(4)：353-356.

[4] 陈倩，金哲，鲁秋丹，等.紫丹饮含药血清在子宫内膜免疫微环境中对内膜容受性的调节[J].国际中医中药杂志，2012，34(3): 220-223.

[5] LI X F,BOWE J E,MITCHELL C,et al.Stress-induced suppression of the gonadotropin releasing hormone pulse generator in the female rat [J].Endocrinology, 2004, 145(4): 1556-1563.

[6] BREMNER J，NARAYAN M，ANDERSON E R，et al.Sm-aller hippocampal volume in major depression[J].Brain Res，2000,12(6):413-431.

[7] 王寅.慢性心理应激大鼠模型的建立及评价研究进展[J].蚌埠医学院学报，2010，35(2):206-208.

[8] 魏伟，吴希美，李元建.药理实验方法学[M].4版.北京：人民卫生出版社，2010：7.

[9] USADI R S，MURRAY M J，BAGNELL R C，et al.Temporal and morphologic characteristics of pinopod expression across the secretory phase of the endome trial cycle in normally cycling women with proven fertility[J].Fertil Steril, 2003, 79(4): 970-974.

[10] 武泽,李蓉,乔杰.辅助生殖技术治疗中子宫内膜容受性标志变化的研究进展 [J].生殖与避孕,2011,31(8):538-543.

[11] KULAK J JR, FERRIANI R A, KOMM B S, et al.Tissue selective estrogen complexes(TSECs)differentially modulate markers of proliferation and differentiation in endometrial cells[J].Reprod Sci,2013 ,20(2):129-137.

[12] CAKMAK H, TAYLOR H S.Molecular mechanisms of trea-tment resist in endometriosis: the role of progesterone-hox gene interactions[J].Semin Reprod Med, 2010,28(1):69-74.

[13] KORYNTORA D，SIBRTOVA K, KLOUCKOVA E,et al.Effects of psychological factors on success ofinvitrofertilization[J].Ceska Gynnekologie，2011，66(4): 264-269.

[14] KLONOFF-COBEN H，BLEHA J，LAM-KRUGLICK P，et al.A prospective study of stress among women undergoinginvitrofertilization or gamete intrafallopian transfer[J].Fertility Sterility，2001，76(4): 675-687.

DOI 10.3870/yydb.2015.06.010

Effect ofJieyuyubaoPrescription on Endometrial Receptivity for the Chronic Stress Rats

GENG Huizhuan1, HE Yi2, ZHOU Shunchang3, WEI Wenshuang1, FANG Honghao1, LI Lierong1

(1.HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430061,China； 2.DepartmentofObstetrisandGynecology,theFirstHospitalofWuhanCity,Wuhan430022,China； 3.ExperimentalAnimalCenter,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

Objective To study the effect ofJieyuyubaoprescription on endometrial pinopodes and HOXa-10 mRNA in chronic stress rats , and to reveal the regulatory mechanisms of the endometrial receptivity. Methods Totally 48 SPF SD rats were randomly divided into three groups with weight stratified: normal control group (group A), model control group (group B) and experimental drug group (group C).Rat model of chronic stress was established in group B and group C.On the first day of stimulation,Jieyuyubaosolution (1 g·mL-1) was intragastrically administered (11.8 mL·kg-1) to the rats of group C at 9:00 am, once daily, and stopped giving at the fourth day of pregnancy (pd4) after being confirmed by vaginal smears.Purified water (11.8 mL·kg-1) was intragastrically administered to the rats of group A and group B at 9:00 am.All the rats were mated at the sex ratio of female：male =2：1 at 16:00 pm on the 21st day.The rats were sacrificed at the pd4.Maturity of endometrium pinopodes was assessed under transmission electron microscope.HOXa-10 mRNA content was evaluated by real-time fluorescence-PCR. Results The maturity of pinopodes was as follows: the maturity score of normal control group, model control group and experimental drug group was (2.7±0.3), (1.3±0.3), and (2.1±0.2), respectively, with significant difference between experimental drug group and model control group (P<0.05).HOXa-10 mRNA expression was significantly decreased in model control group (0.658±0.031) as compared with normal control group (0.965±0.102) (P<0.05). ConclusionJieyuyubaoprescription maybe increase the number and maturity of pinopodes through promoting HOXa-10 mRNA expression in endometrial epithelium cells, and then improve endometrial receptivity.

Jieyuyubaoprescription； Stress, chronic； Endometrial； Receptivity

2014-07-15

2014-12-15

耿会转(1982-)，女，湖北武汉人，博士，研究方向：中医辅助生殖。电话：(0)18571766686，E-mail:289589168@qq.com。

黎烈荣(1954-)，女，湖北武汉人，教授，主任医师，博士生导师，从事中医妇科临床医疗与教学科研工作。电话：(0)18062550013，E-mail：zhuanzhuan001@sina.com。

R289.5； R285.5

A

1004-0781(2015)06-0741-05