茉莉花提取物的舒血管作用*

栾海蓉，王得利，何志鹏，代海兵，吴红

(牡丹江医学院机能学教研室、黑龙江省高校肿瘤疾病防治重点实验室，牡丹江 157011)

茉莉花提取物的舒血管作用*

栾海蓉，王得利，何志鹏，代海兵，吴红

(牡丹江医学院机能学教研室、黑龙江省高校肿瘤疾病防治重点实验室，牡丹江 157011)

目的 观察中药茉莉花提取物(EJs)对大鼠离体胸主动脉环的舒血管作用并探讨其作用机制。方法 采用离体血管环灌流装置，观察EJs对苯肾上腺素(PE)或氯化钾(KCl)预收缩血管的影响。检测左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)和氯化钡(BaCl2)，格列本脲(Gli)对0.5，1，2，4，8 g·L-1EJs舒血管作用的影响；观察EJs对氯化钙(CaCl2)及PE在无钙液中收缩影响；激光扫描共聚焦显微镜技术检测血管平滑肌细胞内钙浓度。结果 在内皮完整血管上，EJs依赖性地降低PE或KCl预收缩血管的张力，最大舒张幅度分别为(105.0±3.2)%，(78.0±6.5)%；L-NAME明显削弱对EJs的舒血管作用(P<0.01)，最大舒张幅度为(58.0±6.9)%；BaCl2，Gli均能明显削弱EJs的舒血管作用(P<0.01)，最大舒张幅度分别为(37.0±5.2)%，(78.0±10.0)%；在无钙环境下，EJs能抑制PE引起去内皮主动脉环短暂收缩(P<0.01)，最大收缩幅度(70.0±6.3)%，EJs能抑制0.5～8 mmol·L-1CaCl2引起的收缩(P<0.01)，血管收缩幅度降低(65.0±3.2)%。4，8 g·L-1Ejs钙Fmax/F0分别为(2.0±0.2)和(1.5±0.2)。结论 EJs 能够浓度依赖性舒张大鼠胸主动脉，其作用机制可能与促进一氧化氮释放、激活多个K+通道，减少细胞内钙离子浓度有关。

茉莉花；动脉环；血管舒张；钾通道；激光扫描共聚焦

茉莉花(Jasminumsamba)是木犀科茉莉(JasminusbacAiton)属植物，常绿灌木，是一种天然高级香料植物，其根、茎、叶、花均有药用价值[1]。中药茉莉花为临床上常用的理气药，具有理气止痛、辟秽开郁的功效，含有挥发油、环烯醚萜、黄酮等化学成分，长期以来一直与其他中药配伍用于多种临床成方制剂。关于茉莉花的药理作用研究并不多见，主要集中于其根部提取物在镇静催眠和麻醉止痛等方面。茉莉花中已有多种具有心血管药理作用的活性成分被分离鉴定，如芦丁、异槲皮苷等，但其提取物的扩动脉效果研究却鲜有报道。笔者在本实验采用离体动脉环方法，观察茉莉花提取物对大鼠离体胸主动脉环的舒血管作用，探讨其作用机制，为临床配伍使用提供更多试验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级雄性Wistar大鼠，体质量250～300 g，购自哈尔滨医科大学，动物生产许可证号：SCXK(黑)2011-0006，动物使用许可证号：SYXK(黑)2011-0007。于屏障环境中进行饲养和实验。

1.2 药品 茉莉花提取物(extract ofJasminumsamba，EJs)的制备：干茉莉花购自河北安国药材市场，由南开大学谢春峰博士鉴定。将茉莉花用20倍量90%乙醇回流提取两次，每次1 h，再用20倍量65%乙醇回流提取两次，每次1 h，提取液减压浓缩干燥成粉末，以适量纯化水溶解，注入聚酰胺柱中使充分吸附平衡，用足量纯化水洗脱不被吸附的成分，然后用60%乙醇充分洗脱，洗脱液减压浓缩干燥成粉末状，以95%乙醇多次充分溶解并滤过，合并溶液减压浓缩干燥成粉末，使用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配成200 g·L-1溶液。

1.3 试剂 苯肾上腺素(phenylephrine，PE，批号：P6126)、卡巴胆碱(Carbacholine，CCH，批号：C4382)、左旋硝基精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine-methylester，L-NAME，批号：N5751)、4-氨基吡啶(4-aminopyrimide，4-AP，批号：A78403)、四乙胺(tetraethylammonium，TEA，批号：T2265)、格列本脲(glybenclamide，Gli，批号：G0639)、氯化钡(BaCl2，批号：202738)、DMSO(批号：D2650)和乙二醇二乙醚二胺四乙酸[glycol-bis-(2-aminoethylether)-N，N，N′，N′-tetraacetic acid，EGTA](批号：E3889)均购自Sigma 公司； Fluo-3 /AM(批号：F-1241)、F-127(批号：P-6866)均购自Invitrogen 公司；其他试剂为国产分析纯。

1.4 仪器 BL-420生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；HV-4血管环灌流系统(成都泰盟科技有限公司)；JH-2肌张力换能器(北京航天医学工程研究所)； 旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)；数控恒温浴锅(上海申胜生物技术有限公司)；真空干燥箱(上海申胜生物技术有限公司)；AL104型电子天平(上海勒-托利多仪器有限公司)；FV-300激光扫描共聚焦显微镜(日本Olympus公司)。

1.5 胸主动脉环的制备 参照文献[2]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL·(100 g)-1麻醉后，打开胸腔，迅速取出胸主动脉，置于 Krebs-Henseleit(K-H)溶液中 [氯化钠(NaCl)118.0 mmol·L-1，氯化钾(KCl)4.7 mmol·L-1，磷酸二氢钾(KH2PO4)1.2 mmol·L-1，硫酸镁(MgSO4)1.2 mmol·L-1，碳酸氢钠(NaHCO3)25.0 mmol·L-1，氯化钙(CaCl2)1.25 mmol·L-1，葡萄糖(Glucose)10.0 mmol·L-1，pH7.2～7.4]，小心剔除其结缔组织和脂肪，将血管制成长2～3 mm的主动脉环，置于 HV-4血管环灌流系统5 mL的血管槽中，浴槽中放置 K-H液，浴槽外层用超级恒温器通以37 ℃的循环水，并持续通以 95% 氧气+5%二氧化碳混合气体。血管环用两根V型不锈钢挂钩贯穿血管管腔，横向悬挂在5 mL浴槽内，下端固定，上方以一细线连于 JH-2肌张力换能器，通过数据线接于 BL-420生物机能实验系统，将血管张力值转换为数据信号，通过电脑显示。主动脉环先在0.5 g张力状态下稳定40 min，待稳定后，调节张力至1.5 g，稳定期间每隔20 min换液一次，稳定约80 min，待静息张力稳定后开始实验。

根据实验需要，用棉签去除血管内皮，使用4.5 μmol·L-1CCH检验血管内皮活性，如果舒张程度达到其收缩的70%认为内皮完整。当CCH不产生舒张作用或舒张幅度小于预收缩的10%时，认为已去除内皮。

1.6 EJs对血管的舒张作用 取内皮完整的血管环，加 PE或 KCl使终浓度分别为10 μmol·L-1和60 mmol·L-1，达收缩平台后，累计加入浓度为0.5，1，2，4，8 g·L-1EJs，记录血管张力变化曲线。

1.7L-NAME对EJs舒血管作用的影响 取内皮完整血管，以L-NAME(3 mmol·L-1)于37 ℃孵育10 min，再加终浓度为 10 μmol·L-1的 PE，达收缩平台后，累计加入浓度为0.5，1，2，4，8 g·L-1的 EJs，记录血管张力变化曲线。

1.8 钾通道阻滞药对EJs舒血管作用的影响 取去内皮血管环，以 4-AP(5 mmol·L-1)，BaCl2(1 mmol·L-1)，TEA(1 mmol·L-1)，GLi(10 μmol·L-1)于 37 ℃孵育10 min，再加终浓度为10 μmol·L-1的 PE，达收缩平台后，累计加入浓度为0.5，1，2，4，8 g·L-1的 EJS，记录血管张力变化曲线；对照组为不加入EJs组。

1.9 EJs对CaCl2量效曲线的影响 取去内皮血管环，换用无钙K-H液(含100 μmol·L-1EGTA)，孵育30 min，期间每隔10 min换无钙K-H液1次，对照组加入无钙高钾液(含KCl 60 mmol·L-1，100 μmol·L-1EGTA)，10 min后，累计加入浓度为 0.5，1，2，4，8 mmol·L-1的 CaCl2，记录血管环收缩曲线。给药组加入无钙高钾液前一次性加入4 g·L-1EJs，孵育10 min后，累计加入浓度为 0.5，1，2，4，8 mmol·L-1的 CaCl2，记录血管张力变化曲线。

1.10 EJs对PE在无钙液中收缩的影响 取去内皮血管环，换用无钙K-H液孵育30 min，期间每隔10 min换新鲜无钙K-H液1次，加 PE使浓度为10 μmol·L-1，记录最大收缩幅度，计算张力差。而后用正常 K-H液反复冲洗标本至张力为1.5 g，重新换无钙液孵育30 min，期间每隔10 min换无钙K-H液 1次，加 PE前10 min一次性加入4 g·L-1的 EJs，加 PE使浓度为10 mmol·L-1，记录第 2次最大收缩幅度，计算张力差，比较前后两次血管张力差。观察在无钙环境下EJs对 PE诱发血管环收缩的影响。

1.11 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的急性分离与激光共聚焦细胞内钙检测 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的急性分离方法见参考文献[3]。取稳定好的细胞，用20 μmol·L-1Fluo-3/AM染色，在37 ℃恒温水浴中孵育50 min，去除负载液后，用正常台氏液再洗涤1次后稀释到所需浓度待定。给药组分别加入4，8 g·L-1EJs，维拉帕米(verapamil，VER)10 μmol·L-1，孵育10 min后加KCl(30 mmol·L-1)；对照组细胞直接加 KCl(30 mmol·L-1)。在Time series XYT模式下扫描记录血管平滑肌[ Ca2+]i，激发波长为488 nm，以Fmax/F0代表相对细胞[Ca2+]i浓度峰值。

2 结果

2.1 EJs对血管的舒张作用 在内皮完整的大鼠胸主动脉环上，EJs可使大鼠胸主动脉环呈浓度依赖性舒张。对KCl预收缩的保留内皮血管环的最大舒张幅度为(78.0±6.5)%，对PE预收缩的保留内皮血管环的最大舒张幅度为(105.0±3.2)%(图1)。

2.2L-NAME对EJs舒血管作用的影响 在内皮完整血管中加入一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制药L-NAME后，能明显减弱EJs对 PE预收缩血管的舒张作用，血管环的最大舒张幅度为(58.0±6.9)%，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.3 钾通道阻滞药对EJs舒血管作用的影响 内向整流型K+通道(KIR)抑制药 BaCl2能明显削弱EJs的舒血管作用，使血管环最大舒张幅度为(37.0±5.2)%，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；KATP非特异性抑制药Gli能明显削弱 EJs的舒血管作用，使血管环最大舒张幅度为(78±10)%，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)(图3)。

图1 EJs 对PE或 KCl预收缩血管的舒张曲线(n=8)

Fig.1 Vasodilation curves of EJs on vasoconstriction induced by PE and KCl(n=8)

与对照组比较，*1P<0.05，*2P<0.01

图2L-NAME对 EJs舒血管作用的影响(n=8)

Compared with control group，*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.2 Effect of L-NAME on EJs-induced vasodilation(n=8)

2.4 EJs对CaCl2量效曲线的影响 EJs能使高钾环境中由Ca2+引起的血管收缩曲线明显右移，使血管的收缩幅度降低(65±3.2)%，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)(图4)。

2.5 EJs对PE在无钙液中收缩的影响 在无钙环境下，EJs能抑制 PE(10 μmol·L-1)引起的去内皮主动脉环的短暂收缩，使血管环最大收缩幅度为(70 .0± 6.3)%，与对照组(99.7±3.1)%比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.6 EJs对平滑肌细胞胞浆[Ca2+]i的影响 将负载后的细胞置于正常台氏液的浴槽中，在倒置显微镜上用激光扫描，并在第 2，第 3次扫描之间加入EJs。EJs可剂量依赖性抑制有钙台氏液中 KCl诱导的平滑肌细胞内[Ca2+]i的升高。EJs在4 g·L-1时钙Fmax/F0为(2.0±0.2)，8 g·L-1时钙Fmax/F0为(1.5±0.2)，与对照组钙Fmax/F0(2.8±0.3)比较，差异有统计学意义(P<0.01)，维拉帕米组钙Fmax/F0(1.3±0.1)。

与对照组比较，*1P<0.01

图3 4-AP，BaCl2，TEA，Gli对 EJs舒血管作用的影响(n=8)

Compared with control group，*1P<0.01

Fig.3 Effect of 4-AP,BaCl2 ,TEA and Gli on EJs-induced vasodilation(n=8)

与对照组比较，*1P<0.01

图4 EJs对CaCl2在无钙高钾环境中引起的血管收缩量效曲线的影响(n=8)

Compared with control group，*1P<0.01

Fig.4 Effect of EJs on dose-response curves of CaCl2-induced vasoconstriction in Ca2+free and K+rich medium(n=8)

3 讨论

血管平滑肌的舒张与多种途径相关，阻断Ca2+通道、开放K+通道、促进一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)合成和释放等。

目前多数人认为内皮舒张因子的化学结构是NO[4]，NO在NOS的作用下生成NO，而激动内皮细胞 M3胆碱受体亚型可导致 NO释放，NO可使血管平滑肌内的鸟苷酸环化酶激活，cGMP浓度升高，游离 Ca2+的浓度降低，故血管舒张。本实验发现，内皮完整的血管环，用NOS阻断药L-NAME预处理后，EJs的舒张血管强度明显降低，提示EJs的舒血管作用可能与NO介导的途径有关。

K+通道在调节血管平滑肌收缩及血管张力中具有重要作用[5]。血管平滑肌上主要存在4种 K+通道：ATP敏感 K+通道(KATP)，Ca2+激活的 K+通道(Kca)，电压敏感型 K+通道(Kv)及内向整流型 K+通道(KIR)，Gli为 KATP非特异性抑制剂，TEA，4-AP 和 BaCl2分别是Kca，Kv和 KIR抑制药[6-7]。本研究显示，用Gli和BaCl2孵育后，EJs的血管舒张作用均受到明显抑制。以上结果提示 EJs的血管舒张作用还与多种 K+通道有关。

关于 PE和KCl的舒张机制，已有研究表明，虽然两者都可通过增加细胞内钙离子的浓度而引起血管收缩，但机制却不同[8-10]。KCl可以通过使膜电位去极化激活电压依赖型钙通道，导致细胞外钙内流而引起动脉环收缩。而PE诱导的血管收缩作用主要通过激活细胞膜上的受体操控性钙通道使细胞外钙内流，还可以与作用于α1肾上腺素受体，激活磷脂酶C产生三磷酸肌醇，刺激平滑肌细胞内贮钙的释放，从而引起血管收缩。实验中，EJs能浓度依赖性地拮抗由PE或KCl引起的血管收缩，提示EJs可能抑制高钾和PE引起的外钙内流或者是抑制了细胞内钙库的钙释放，从而产生舒张作用。

用无钙K-H灌流液处理后，EJs预处理可使Ca2+的量效曲线右移，最大收缩幅度降低，并且抑制PE在无钙液中诱导的血管收缩，初步证实EJs可以抑制外钙内流和内钙释放，从而抑制细胞内Ca2+浓度的升高，使血管舒张。为了更明确的证实EJs降低细胞内钙的作用，应用激光共聚焦扫描显微镜技术研究发现，KCl除极后的细胞内钙显著升高，而用EJs处理的血管平滑肌细胞，可以浓度依赖性地抑制其细胞内钙浓度的升高，进一步证实EJs确实具有抑制细胞外钙内流而舒张血管环的作用。

通过本次实验，对EJs舒张血管的作用与机制有了初步了解，证实EJs能够浓度依赖性地舒张血管，其舒血管效应可能与激活血管内皮舒血管功能、开放血管平滑肌多个钾离子通道、抑制细胞外钙内流与阻止细胞内钙释放有关。但具体化学成分所起的药理作用，需进一步分离纯化后，加以确定。对于不同的高血压患者，由于疾病所导致的血管内皮细胞的完整性会存在较大差异，因此茉莉花提取物丰富的K+、Ca2+通道舒血管机制，弥补一些中药刺激内皮释放 NO不足，本研究结果对临床上合理使用茉莉花具有一定的指导意义。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.009

Vasodilation Effect of Extract ofJasminumsamba

LUAN Hairong, WANG Deli, HE Zhipeng, DAI Haibing, WU Hong

(DepartmentofFunctionalMedicine,MudanjiangMedicalCollege,KeyLaboratoryofCancerProtectionandTreatmentofHeilongjiangProvince,Mudanjiang157011,China)

Objective To observe the vasodilation effect of extract ofJasminumsamba(EJs), a kind of traditional Chinese medicine, onexvivorat thoracic aortic rings, and to investigate its mechanism. Methods Onexvivoaortic ring perfusion device, influence of EJs on contraction of the aorta induced by phenylephrine (PE) or potassium chloride (KCl) were observed.Influence ofN-nitro-L-arginine-methylester (L-NAME), barium chloride (BaCl2), glibenclamide (Gli) on vasodilating effect of EJs (0.5, 1, 2, 4, 8 g·L-1) were detected.Effect of EJs on the contraction of calcium chloride (CaCl2) and PE in Ca2+-free medium were detected.[Ca2+]iin vascular smooth muscle cells was determined by using laser scanning confocal microscope (LSCM). Results In blood vessels with intact endothelium, EJs concentration-dependently decreased PE- or KCl-induced vasoconstriction, the maximum dilating effect being (105.0±3.2)% and (78.0±6.5)%, respectively；L-NAME affected the vasodilatory effect of EJs on thoracic aorta rings (P<0.01), the maximum dilatory effect being (58.0±6.9)%.BaCl2and Gli had significant influence on vasodilation of EJs, and the contraction was obviously attenuated (P<0.01), the maximum dilatory effect being (37.0±5.2)% and (78.0±10.0)%, respectively.EJs significantly inhibited contracting effect of PE on thoracic aorta rings in Ca2+-free medium (P<0.01).The maximum contraction effect was (70.0±6.3)%.EJs inhibited CaCl2-induced vasoconstriction (0.5-8 mmol·L-1), and vasoconstriction was decreased by (65.0±3.2)%.LSCM recorded thatFmax/F0of 4 and 8 g·L-1EJs was (2.0±0.2) and (1.5±0.2), respectively. Conclusion EJs exerted a dose-dependent vasodilating effect on rat isolated aorta rings.The mechanism might be related to promoting NO release, activating K+channels and decreasing the concentration of cytoplasmic Ca2+.

Jasminumsamba； Aorta rings； Vasodilation； K+channel； Laser scanning confocal microscope

2014-05-07

2014-07-31

*黑龙江省中医药科研项目(ZHY12-W051)；黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12531731)；牡丹江医学院科研项目(ZS201321)

栾海蓉(1978-)，女，浙江千岛湖人，讲师，硕士，研究方向：心血管药理。电话：(0)13555001150，E-mail：vivian7835@163.com。

吴红(1971-)，女，山东招远人，硕士生导师，博士，研究方向：心血管药理。电话：(0)15846756265，E-mail：whmedu@126.com。

R965

A

1004-0781(2015)06-0737-05