壳聚糖凝胶对醋酸诱导大鼠直肠损伤的影响*

黎小平，黄宗海，胡立春，楼彩霞

(1.南方医科大学附属珠江医院普外科，广州 510280；2.广东省佛山市南海区第三人民医院普外科，佛山 528244；3.广东省医学实验动物中心，佛山 528248)

壳聚糖凝胶对醋酸诱导大鼠直肠损伤的影响*

黎小平1，2，黄宗海1，胡立春2，楼彩霞3

(1.南方医科大学附属珠江医院普外科，广州 510280；2.广东省佛山市南海区第三人民医院普外科，佛山 528244；3.广东省医学实验动物中心，佛山 528248)

目的 检测壳聚糖凝胶对醋酸诱导的大鼠直肠损伤的影响。方法 将大鼠麻醉，以4%醋酸棉签经大鼠肛门置入直肠1 min，深度3 cm，制备大鼠直肠损伤模型36只，随机分为模型对照组、阳性对照组和药物组，每组12只。药物组经肛门给予壳聚糖凝胶 1 575 mg·kg-1，阳性对照组给予痔疮膏1 575 mg·kg-1，连续6 d，给药后30 min，1，4，6 d，各组分别处死大鼠3只，解剖大鼠，肉眼观察大鼠直肠损伤情况，观察各组之间在给药各时间段的直肠病理学形态差异。结果 给药组用药30 min，1，4，6 d后，大鼠直肠黏膜损伤计分较模型对照组和阳性对照组低，上皮组织坏死、间质充血、出血、水肿、腺体破坏、炎症细胞浸润等病理现象明显较模型对照组和阳性对照组轻，修复速度较模型对照组和阳性对照组快，并且没有较明显的瘢痕出现。结论 壳聚糖凝胶可明显减轻4%醋酸造成的直肠损伤，具有一定的治疗作用。

壳聚糖凝胶；损伤，直肠；醋酸

痔是常见病和多发病，可伴有出血、脱垂等症状。近年来痔的保守治疗取得很大的进步，但痔的切除率下降及肛垫保存术的兴起并非意味着传统的痔切除手术不重要，特别对于痔已发展为Ⅲ度、Ⅳ度，无论是病理解剖，还是生理功能已不再具有可逆性的时候，手术治疗尤显得重要[1]。它仍然是目前疗效确切的常用方法。临床上应用最多的仍是传统的外剥内扎术。然而疼痛、出血、感染、肛周水肿及创面延迟愈合等是痔手术后的常见并发症，长期困扰广大医务人员。壳聚糖是一种天然高分子聚合物，生物相容性好，毒性低，可生物降解，具有抗菌、止血和成膜作用，广泛应用于生物工程等领域，但目前在痔疮领域应用甚少。笔者在本实验通过探讨壳聚糖凝胶对醋酸诱导直肠损伤模型的作用[2]，旨在寻找一种药物减少或减轻术后并发症。

1 材料与方法

1.1 动物 无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠36只，合格证号：44007200003906，雄性，体质量：180～220 g；由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002，动物使用许可证号：SYXK(粤)2008-0002。动物饲养在广东省医学实验动物中心SPF级动物房，动物饲养条件：每只大箱饲养6只，饲养温度20～26 ℃，相对湿度：40%～70%，采用10 h：14 h昼夜间断照明；饲养室条件始终保持稳定，以保证实验结果的可靠性。大鼠自由进食饮水，颗粒饲料和饮用水均由广东省医学实验动物中心提供。

1.2 试药 4%醋酸(广州中南化学试剂有限公司，批号：130113，配制方法：准确量取醋酸1 mL，加入到纯化水24 mL中，混匀。壳聚糖凝胶(沈阳博大精益生物制药有限公司，批号：130802，规格：每支3 g)。阳性对照痔疮膏(规格：每支2.5 g)。

1.3 仪器 TS-12N全自动生物组织脱水机(孝感宏业医用仪器有限公司)；BM-VⅡ生物组织包埋机(孝感宏业医用仪器有限公司)；RM2135石蜡切片机(德国Leica公司)；CS-VⅠ摊片烤片机(孝感宏业医用仪器有限公司)；RS-18Ⅱ生物组织自动染色机(孝感宏业医用仪器有限公司)；BX41病理图像分析系统(日本奥林巴斯)。

1.4 动物模型的建立 用饱和苦味酸对大鼠进行编号，在大鼠体表不同部位的被毛涂染斑点，以示不同号码。以大鼠皮肤染色和笼具双重编号标记识别。对购入大鼠检疫3 d。期间每日检查大鼠一次，未发现不健康的动物，全部纳入实验。造模前，大鼠禁食1 d，将大鼠麻醉，以4%醋酸棉签经大鼠肛门置入直肠1 min，深度3 cm，制备大鼠直肠损伤模型36只。

1.5 大鼠分组和给药方法 从实验开始至实验结束每天观察动物1次。实验开始测量体质量1次。将36只大鼠随机分为3组：模型对照组、药物组和阳性对照组每组12只。大鼠给药前，予以麻醉。药物组在直肠损伤后30 min～6 d，经肛门给予壳聚糖凝胶，置入深度为3 cm，给药剂量为1 575 mg·kg-1[按人的给药剂量(50 mg·kg-1·d-1)换算，使用大鼠等效剂量的5倍]，每日1次，给药后按压大鼠直肠使凝胶融化并分布均匀；阳性对照组给予痔疮膏，置入深度为3 cm，给药剂量为1 575 mg·kg-1，每日1次，给药后按压大鼠直肠使药物分布均匀。模型对照组给予同样的按压，但不给药物。

1.6 损伤计分 给药后30 min和1，4，6 d各个时间段，各组分别麻醉处死大鼠3只(共12只)，解剖大鼠，肉眼观察大鼠直肠损伤情况，参照文献[2]黏膜损伤计分方法，记录黏膜损伤分数：点线状出血、小红斑(<1 mm)计为1分；片状出血、大红斑(≥1 mm)计为3分；糜烂和溃疡计为5分。

1.7 病理形态观察 所有直肠标本常规脱水、包埋、切片、苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，光镜观察并摄像，观察各组之间、给药各时间段的直肠病理学形态差异。

2 结果

2.1 损伤计分 药物组给予壳聚糖凝胶30 min，1，4，6 d后，大鼠直肠黏膜损伤计分较模型对照组和阳性对照组低。见表1。

2.2 给药30 min病理结果 模型对照组直肠损伤30 min时，肠黏膜下出血、水肿和糜烂，镜下见黏膜上皮组织坏死，部分腺体留存，黏膜下层水肿，间质血管扩张充血。阳性对照组直肠损伤有所减轻，镜下见黏膜上皮组织坏死，部分腺体留存，黏膜下层水肿，间质血管扩张充血；药物组损伤稍减轻，镜下见黏膜上皮组织坏死，部分腺体留存，局部黏膜层出血，黏膜下层水肿，间质血管扩张充血。见图1。

2.3 给药1 d病理结果 模型对照组直肠损伤1 d时，肠黏膜下出血、水肿和糜烂，镜下见黏膜层全层坏死伴出血，未见腺体留存，黏膜下层水肿、充血、局部出血、间质炎细胞浸润。阳性对照组直肠损伤减轻，镜下见黏膜层全层坏死、出血，黏膜下层水肿、充血、炎细胞浸润。药物组直肠损伤明显减轻，镜下见部分黏膜层坏死、出血，黏膜下层水肿、充血、出血、炎细胞浸润。见图2。

表1 3组大鼠给药不同时间直肠黏膜损伤计分

与模型对照组比较，*1P<0.05；与阳性对照组比较，*2P<0.05

Compared with model control group，*1P<0.05；compared with positive control group，*2P<0.05

图1 3组大鼠直肠损伤造模给药30 min直肠黏膜损伤和病理图片(HE，×200)

A.model control group；B.positive control group；C.drug group)

Fig.1 Mucosal injury of rectum and its pathology of three groups of rats 30 min after modeling of rectal injury(HE，×200)

图2 3组大鼠直肠损伤造模给药1 d直肠黏膜损伤和病理图片(HE，×200)

A.model control group；B.positive control group；C.drug group

Fig.2 Mucosal injury of rectum and its pathology of three groups of rats one day after modeling of rectal injury(HE，×200)

2.4 给药4 d病理结果 模型对照组直肠损伤4 d时，肠黏膜下出血、水肿和糜烂减轻，镜下见上皮及腺体损伤依然严重，大量黏膜层全层坏死，黏膜下层大量肉芽组织增生、炎细胞浸润。阳性对照组直肠损伤稍减轻，镜下见上皮及腺体损伤稍减轻，黏膜上皮覆盖不明显，局部少量黏膜上皮组织脱落。药物组直肠损伤明显减轻，镜下见黏膜上皮覆盖明显，局部少量黏膜上皮组织脱落。见图3。

2.5 给药6 d病理结果 模型对照组直肠损伤6 d时，肠黏膜下出血、水肿和糜烂减轻，镜下见上皮及腺体损伤依然严重，部分黏膜上皮组织全层坏死，黏膜下层大量肉芽组织增生、炎细胞浸润。阳性对照组直肠损伤大部分痊愈，镜下见黏膜上皮大部分组织完整，只见少量的坏死、充血、出血、水肿、炎症细胞浸润等病理变化。药物组直肠损伤基本痊愈，镜下见黏膜上皮组织完整，未见明显的坏死、充血、出血、水肿、炎症细胞浸润等病理变化。同时取正常大鼠(正常对照组)，处理后取肠黏膜观察，并作病理切片，各组进行比较。见图4。

图3 3组大鼠直肠损伤造模给药4 d直肠黏膜损伤和病理图片(HE，×200)

A.model control group；B.positive control group；C.drug group

Fig.3 Mucosal injury of rectum and its pathology of three groups of rats four days after modeling of rectal injury(HE，×200)

3 讨论

壳聚糖是一种天然高分子聚合物，属于氨基多糖，学名：(1.4)-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖。它是少见的带正电荷的高分子化合物，是至今为止发现的唯一带阳离子电荷的碱性多糖[3]，壳聚糖在自然界中广泛存在于低等生物菌类、藻类的细胞和节肢动物虾、蟹、昆虫等的外壳中。

壳聚糖凝胶(Ⅲ型)是以壳聚糖为主要材料，是一种生物可降解性高分子多糖类生物材料，为芳香、半透明的凝胶，不溶于水，动力黏度不低于1 000 mPa·s-1，pH 为4.0～7.0，生物相容性好，毒性低，可生物降解。

壳聚糖对多种细菌的生长具有抑制作用，是抗菌谱较广的天然抗菌物质，对革兰阳性菌、革兰阴性菌及真菌，均有明显抑制效果[4-6]。其抑菌机制的最新研究表明：壳聚糖并不是通过干扰细胞质的正常分布而产生作用，而是首先引起细菌细胞内酶外泄与细菌细胞壁的损坏影响细胞壁的正常功能，使从而导致菌体的死亡。

壳聚糖有良好的止血效果，虽然目前对于壳聚糖的止血机制尚未完全了解，但可以肯定的是其与常规的依赖血小板和凝血因子的瀑布机制不同。壳聚糖的止血机制随着研究的深入，越来越多的学者认为其止血作用不仅与血小板聚集有关，更与红细胞聚集有关，红细胞膜的负电荷与壳聚糖的正电荷基团间的离子作用力是壳聚糖止血活性的一个可能的原因。

另外壳聚糖有明显的膜形成作用，2 min 内可以在伤口自然成一层膜，将直肠内恶劣的环境有效隔离，这样可以保护创面，明显减轻创面的疼痛。

近年来，在食品、药品、保健、生物医药领域的应用日益引起人们的高度重视[7]，但其在痔术后的应用临床效果国内外报道目前较少见。

通过本实验，可看出壳聚糖凝胶可明显减轻4%醋酸造成的直肠损伤，具有一定的治疗作用。但壳聚糖凝胶在临床上的应用及效果还有待于进一步的临床实验研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.008

Effect of Chitosan Gel on the Rectum Injury Induced by Acetic Acid in Rats

LI Xiaoping1,2,HUANG Zonghai1,HU Lichun2,LOU Caixia3

(1.DepartmentofGeneralSurgery,ZhujiangHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510280,China；2.DepartmentofGeneralSurgery,theThirdPeople’sHospitalofNanhaiDistrict,FoshanCity,GuangdongProvince,Foshan528244,China；3.MedicalAnimalExperimentCenterofGuangdongProvince,Foshan528248,China)

Objective To detect the effect of chitosan gel on rectal injury which was induced by acetic acid. Methods 36 rats were anesthetized, 4% acetic acid swab was placed into the rectum (3 cm in depth for 1 min) to establish rectum injury model.These rats were divided into model control group, positive control group and drug group with 12 rats each group randomly.Chitosan gel was given to the drug group through anus with the dose of 1 575 mg·kg-1, and hemorrhoid cream (1 575 mg·kg-1) was administered in the positive control group for 6 successive days.At 30 min, 1, 4, 6 day(s) after administration, 3 rats of each group were sacrificed， and were dissected, rectal injury and rectal pathology morphology changing of each group at different time points of administration were compared through visual observation. Results At 30 min, 1, 4, and 6 day(s) after administrating chitosan gel, score of rectum mucosa injury in dury group was lower than those in model control and positive control group.Pathological changes (including epithelial tissue necrosis, mesenchyme hyperemia, hemorrhage, edema, gland injury, infiltration of inflammatory cells) were significantly slighter in drug group than in model control group and positive control group.Those lesions were restored faster in drug group than in model control group and positive control group, and there was no obvious scar. Conclusion Chitosan gel can obviously alleviate the rectal injury caused by 4% acetic acid and has therapeutic effect.

Chitosan gel；Injury, rectum； Acetic acid

2014-04-02

2014-07-31

*佛山市医学类科技攻关项目(201308149)

黎小平(1975-)，男，江西南城人，副主任医师，在读博士，研究方向：痔疮治疗的进展。电话：(0)18124804355，E-mail：pingli1975@sina.com。

R965；R657.1

A

1004-0781(2015)06-0733-04