骨髓间充质干细胞体外增殖的策略

李瑞妮，荣为为综述，金世柱，韩明子审校

0 引 言

现在干细胞移植的研究及治疗已成为热点问题，但是干细胞移植仍存在许多问题，如干细胞获得效率、移植数量和时机、移植的最佳途径、移植后定位跟踪及体内分化、安全性问题，其中体外扩增骨髓间充质干细胞是所有问题之一［1］。

骨髓间充质细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是成体干细胞的一种，具有多向分化潜能，使利用BMSCs 治疗相关疾病成为可能。但是BMSCs 含量极少，约为骨髓单个核细胞的十万分之一，不利于其研究及应用，因此需经过体外增殖才能满足应用需求。本文就骨髓间充质干细胞体外培养的主要方法及策略进行综述。

1 血清培养法

吴刚等［2］采用Ficoll 密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞，分别在含脐血清、胎牛血清、及无血清的L-DMEM 培养基中培养，证实脐血清和胎牛血清均能促进细胞增殖，但BMSCs 在脐血清中增殖更活跃，在无血清L-DMEM 培养液中BMSCs 基本无增殖。BMSCs 增殖需要多种因子协同作用，而脐血清含有与间充质干细胞增殖有关的细胞因子和生长因子，如血小板转化生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子，这些因子形成间充质干细胞所需的天然配比，同时脐血清取材方便，临床获取较为容易，含有免疫原性的物质更少、更安全［3］。但是血清培养经常被病毒污染，其中存在许多可能对细胞培养有害且不受操控的未知因素。

2 细胞培养法

目前，据骨髓间充质干细胞表面标记、细胞形态、颗粒大小，用于分离培养BMSCs 的方法主要有以下几种:全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法。

2.1 全骨髓贴壁培养法 全骨髓贴壁培养法是利用BMSCs 对塑料底的贴附性，定期换液去除悬浮生长的造血系细胞进行分选纯化。这种方法省略了BMSCs的分离步骤，从而减少了细胞的污染和丢失。全骨髓贴壁接种法操作简便，对细胞损伤小，应用广泛，是获得骨髓间充质干细胞最简便、有效的分离和纯化方法［4］。宫宇等［5］采用全骨髓贴壁接种法进行体外分离培养SD 大鼠骨髓间充质干细胞，经流式细胞仪检测细胞表面分子的表达，表明此种方法不需离心，造成污染的环节和机会较少，可以更好地保持细胞的活性状态，获得的干细胞贴壁能力强，细胞形态均一，胞体饱满，呈梭形，具有较高的生物活性适合作为种子细胞。

2.2 密度梯度离心法 密度梯度离心法是BMSCs分离、纯化和扩增最常用的方法，是根据BMSCs 与其他细胞密度不同，利用Percoll 分离液将BMSCs 分离出来，除去多余的红细胞、粒细胞等其他细胞，得到高纯度的BMSCs，但是操作繁琐，耗时长且容易丢失，并增加了细胞污染的可能性。有实验利用密度梯度离心法分离出人骨髓单个核细胞(mononuclearcells，MNC)，通过贴壁筛选法建立人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymalstem cell，hBMSC)的体外培养体系，按照此培养体系进行培养可获得hBMSC，但在培养过程中细胞逐渐出现老化现象，且不能冻存［6］。

李英慧等［7］用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化成年大鼠BMSCs，发现此种方法能有效地分离纯化成年大鼠BMSCs，所获的细胞形态均一，增殖速度快，生长性状稳定，且操作简便，成本低。穆晓红等［8］采用密度梯度离心法培养兔BMSCs，对细胞的形态及生长特性进行观察，应用流式细胞仪检测 细 胞 表 面 抗 原CD29、CD34、CD44、CD45、CD166、HLA-DR 表达，并进行相关生物学特性鉴定，发现密度离心法能分离培养出纯度较高的BMSCs。流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表达CD29、CD44、CD166，不表达CD34、CD45、HLA-DR，因此此种方法可以分离得到抗原表型均一、纯度较高、生物学特性稳定的BMSCs。

2.3 流式细胞仪与免疫磁珠分离法 有实验利用免疫磁珠法分离成人骨髓神经生长因子受体(nerve growth factor receptor，NGFR)阳性细胞，获得同质性BMSCs 并进行向软骨细胞诱导。实验采用Percoll密度梯度离心法分离成人骨髓中MNCs，对MNCs 进行常规贴壁培养或者应用磁珠分离技术分离NGFR阳性细胞，证明NGFR 是一个原始BMSCs 表面标志，将其与免疫磁珠分离技术相结合，可从骨髓中筛选出NGFR 阳性细胞，从而获得具有同质功能型和免疫表型的原始BMSCs［9］。免疫磁珠分离获得NGFR阳性细胞的纯度为(90.6±5.1)%，NGFR 阳性细胞较贴壁培养获得BMSCs 具备更强增殖能力和向软骨分化潜能。利用免疫磁珠分离骨髓NGFR阳性可以获得同质性原始BMSCs。

流式细胞仪分离法利用BMSCs 体积小和表面抗原的特殊性分离出纯度较高的BMSCs。此2 种方法虽可获得较高纯度的干细胞，但存在成本高、操作繁琐以及体外操作时间长等缺点，且对细胞损伤较为严重，对细胞的活性有部分影响，因此未能得到很好的推广。

3 共培养体系

20 世纪90 年代中后期，共培养广泛应用于细胞—细胞间相互作用的基础生物学研宄。共培养的实验表明细胞与细胞间的相互作用在组织和器官的构建中起重要作用［10］。

共培养中细胞与细胞之间的接触方式有多种，包括细胞与细胞之间的混合单层共培养，细胞与细胞间的分层渗透培养等。有研究采用骨髓间充质干细胞并构建单层共培养、细胞非接触同时联合生物诱导的方法，联合不同诱导机制使其效应增强。细胞微团的三维培养方法既减少细胞运动中其相互接触的机会，又同时带来微团中心细胞液化、坏死等情况，但获取细胞数量有限［11］。

有实验使用关节软骨和骨髓间充质干细胞共培养以考察细胞和细胞之间的相互作用，发现可以促进骨髓间充质干细胞的生长［12］。张治金等［13］将兔骨髓间充质干细胞接种于人脱细胞羊膜上，体外共培养后进行形态学观察。实验观察到羊膜与骨髓间充质干细胞体外共培养提示羊膜的生物相容性良好，并能促进骨髓间充质干细胞的生长及增殖。

4 细胞因子的促进作用

细胞因子是一类具有调节细胞生长、增殖、分化、迁移和基因表达等生物效应的多肽类物质，对细胞增殖、组织或器官的修复、再生具有重要的促进作用。常见的细胞因子包括生长因子，如表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、干细胞生长因子及集落刺激因子等。

4.1 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF) bFGF 是一种内源性多肽生长因子，主要分布于富含血管的组织中，如大脑、垂体、视网膜等。bFGF 具有多重生物学效应，是调控BMSCs 增殖和定向分化的首选生长因子之一。有实验研究表明培养基中加入bFGF 可减缓BMSCs增殖速度的下降趋势，细胞培养的第4 ～6 天后，细胞仍呈上升趋势，表明bFGF 可促进BMSCs 增殖，更好地维持BMSCs 的生长状态［14］。

4.2 粒细胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，G-CSF) G-CSF 是由单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生的一种造血生长因子，它是一种促粒细胞增殖的细胞因子，其生物效应通过与效应细胞表面特异性受体(G-CSF 受体)结合而产生。由于BMSCs 也有G-CSF 受体，这就为G-CSF 提供了作用靶点。体内实验表明，G-CSF 可增加骨髓中具有BMSCs 特性的成纤维样细胞集落(colonyforming units-fibroblast，CFU-F)的含量，预示G-CSF 具有促进BMSCs 活性的潜力［15］。李洪等［16］采用差速贴壁法分离细胞，并进行鉴定。按不同浓度给 予G-CSF，分 为4 组(G0～3组)，G0组 不 含G-CSF，设为阴性对照，G1～3组分别含G-CSF 5、10、20 ng/mL，按1×105/mL 密度接种于平底96 孔培养板中(每孔100 μL)。MTT 法测定各组加入G-CSF第1、3、5、7 天吸光度(A 值)的变化，观察G-CSF 对BMSCs 增殖的影响，结果表明G-CSF 具有促进BMSCs增殖的作用。有实验证实G-CSF 有促进BMSCs增殖的作用［17］。

5 生物反应器

在干细胞的培养过程中，传统静态细胞培养方法扩增间充质干细胞既费时又易被污染，随着间充质干细胞在临床应用的增加，急需一种能快速扩间充质干细胞的方法。生物反应器是整个过程的关键设备，它为细胞提供适宜的生长环境并决定着细胞的质量和产量。生物反应器包括以下几种类型:搅拌式生物反应器、旋转式生物反应器、中空纤维生物反应器、膜生物反应器等。

有实验采用生物反应器扩增骨髓间充质干细胞，不但能够使BMSCs 在数量上得到扩增，而且能够使扩增后的BMSCs 在质量上有所保证，对于解决临床应用上所面临的BMSCs 来源受限、数量不足及质量不高的难题无疑具有重大意义［18］。实验利用微载体悬浮培养体系在搅拌式生物反应器内扩增骨髓间充质干细胞，和静态培养的培养瓶培养方式比较发现，反应器内的BMSCs 能够在cytodex-3 表面更好的黏附、贴壁并保持活跃的生长状态，当BMSCs于第5 天达到增殖高峰时，平均可扩增10.55 倍，明显优于对照组的6.10 倍(P ＜0.05)［19］。

6 诱导性多能性干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)

日本科学家Yamanaka 等［20］发现用4 种转录因子(Oct4，Sox2，Klf4 和c-Myc)可以在体外直接诱导小鼠皮肤成纤维体细胞成为具有像胚胎干细胞样的具有多发育潜能的多能干细胞，这种细胞被称为iPS。最新研究表明，iPS 具有和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)类似且优于ESCs 的特性，又不存在ESCs 所面临的伦理和免疫排斥问题［21］。Darabi 等［22］在人ESCs 和iPS 细胞中条件性表达PAX7，获得了大量的肌源性干细胞，然后将这些细胞移植到患有肌营养不良的小鼠骨骼肌内。他们在移植后的小鼠体内检测到人源的高强度肌纤维，并且可以持续存在11 个月。Rashid 等［23］利用遗传性肝脏疾病患者身上的皮肤细胞重编程为iPS，然后培育成肝细胞，可用于试验各种药物，对于制备疾病的新模型和药物的研发等具有重要意义。

由于现在获得的iPS 细胞大多是通过病毒介导表达转录因子建立起来的，这样的iPS 细胞基因组DNA 中有随机插入的病毒DNA，存在产生肿瘤的风险，因此无法应用到患者身上［24］。

7 中 药

中药有两千多年的历史，资源丰富，具有滋阴补阳、抗衰老和调节免疫功能、毒副作用小、疗效好等特点，可能含有大量能促进BMSCs 增殖、分化的成分，因此被广泛应用于诱导BMSCs 增殖研究中。如黄芪不仅能够促进BMSCs 的增殖，还能抑制其凋亡［25］。黄凤等［26］采用采集空白对照大鼠、益气药、活血药、益气活血药灌胃大鼠含药血清，用10%浓度以上不同含药血清培养第3 代BMSCs，置于37 ℃，5%CO2培养箱中孵育。用流式细胞术鉴定BMSCs，结果表明益气活血中药含药血清对培养BMSCs 增殖有促进作用。人参皂苷不仅能够促进BMSCs 的增殖，还能诱导其向神经元样细胞以及心肌样细胞分化。有实验结果证明人参皂苷可促进BMSCs 增殖［27］。

8 结 语

BMSCs 作为再生医学中的种子细胞，已经成为医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点，要想使其应用于临床，进行大量扩增是需要解决的关键问题。上述几种促进BMSCs 增殖的方法，虽然在BMSCs 的扩增方面起到了关键性作用，但是每种方法都存在或多或少的缺陷，需要更加深入地进行探究。目前，利用上述方法对BMSCs 进行大量扩增仍存在一定的局限性，暂时还无法进行推广应用。因此，寻求一种更为简便、经济、安全、有效的扩增BMSCs的方法显得尤为重要。

［1］ 冉黎婧，史明霞，洪 敏.间充质干细胞归巢机制研究进展［J］.医学研究生学报，2014，27(4):423-426.

［2］ 吴 刚，何 辉，曹月诚，等.不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010，24(49):9151-9154.

［3］ Choi J，Chung JH，Kwon GY，et al.Effectiveness of autologous serum as an alternative to fetal bovine serum in adipose-derived stem cell engineering［J］.Cell Tissue Bank，2013，14(3):413-422.

［4］ Peter S，Scutt AM，Wright PC，et al.Comparative study of in vitro expansion of bone marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Biotechnol Lett，2013，35(3):463-469.

［5］ 宫 宇，王鸿飞，夏海军.全骨髓贴壁接触培养SD 大鼠骨髓间充质干细胞［J］.中国组织工程研究，2014，28(1):51-56.

［6］ 朱迎兰，朱瑞乔，史小蕾，等.三维联通纳米氧化锆多孔支架对犬骨髓间充质干细胞附着生长的实验研究［J］.医学研究生学报，2014，27(6):564-567.

［7］ 王英慧，郑 瑞，陈 莉，等.密度梯度离心及贴壁分离筛选相结合分离培养大鼠骨髓间充质干细胞［J］.中国组织工程研究，2014，18(28):4463-4468.

［8］ 穆晓红，赵子义，徐 林，等.密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞的分化能力［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15(27):4955-4958.

［9］ Shi Y，Su J，Roberts AI，et al.How mesenchymal stem cells interact with tissue immune responses［J］.Trends Immunol，2012，33(3):136-143.

［10］ Battiston KG，Cheung JW，Jain D，et al.Biomaterials in co-culture systems:Towards optimizing tissue integration and cell signaling within scaffolds［J］.Biomaterials，2014，35(15):4465-4476.

［11］ 韦葛堇，黄育强，覃万安，等.髓核细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化［J］.中国组织工程研究ISTIC，2013，12(45):117-123.

［12］ Dahlin RL，Ni M，Meretoja VV，et al.TGF-β3-induced chondrogenesis in co-cultures of chondrocytes and mesenchymal stem cells on biodegradable scaffolds［J］.Biomaterials，2014，35(1):123-132.

［13］ 张治金，郭 林，赵德伟.兔骨髓间充质干细胞与羊膜的共培养［J］.中国组织工程研究，2012，16(27):4959-4962.

［14］ Xiong N，Yang H，Liu L，et al.bFGF promotes the differentiation and effectiveness of human bone marrow mesenchymal stem cells in a rotenone model for Parkinson's disease［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2013，36(2):411-422.

［15］ Schürch CM，Riether C，Ochsenbein AF.Cytotoxic CD8+T cells stimulate hematopoietic progenitors by promoting cytokine release from bone marrow mesenchymal stromal cells［J］.Cell Stem Cell，2014，14(4):460-472.

［16］ 李 洪，许志恩，李 维，等.粒细胞集落刺激因子对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响［J］.中国脑血管病杂志，2008，5(10):461-465.

［17］ Miranda JP，Filipe E，Fernandes AS，et al.The human umbilical cord tissue-derived MSC population UCX©promotes early motogenic effects on keratinocytes and fibroblasts and G-CSF-mediated mobilization of BM-MSCs when transplanted in vivo［J］.Cell Transplant，2013，23(5):324-332.

［18］ Lee MW，Kim DS，Yoo KH，et al.Human bone marrow-derived mesenchymal stem cell gene expression patterns vary with culture conditions［J］.Blood Res，2013，48(2):107-114.

［19］ Lee MW，Kim DS，Yoo KH，et al.Ex vivo expansion of bone marrow mesenchymal stem cells using microcarrier beads in a stirred bioreactor［J］.Blood Res，2013，18(1):173-184.

［20］ Yamanaka S，朱丽华，郭礼和.诱导多能干细胞(iPSCs)过去、现在和未来［J］.中国细胞生物学学报，2012，34(10):1055-1062.

［21］ Zdzieblo D，Li X，Lin Q，et al.Pcgf6，a polycomb group protein，regulates mesodermal lineage differentiation in murine ESCs and functions in iPS reprogramming［J］.Stem Cells，2014，32(12):3112-3125.

［22］ Darabi R，Arpke RW，Irion S，et al.Human ES-and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice［J］.Cell Stem Cell，2012，10(5):610-619.

［23］ Rashid ST，Corbineau S，Hannan N，et al.Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells［J］.J Clin Invest，2010，120(9):3127-3136.

［24］ Miura K，Okada Y，Aoi T，et al.Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines［J］.Nat Biotechnol，2009，27(8):743-745.

［25］ 黄 进，张 进，徐志伟.黄芪多糖对体外培养骨髓间充质干细胞增殖和干细胞因子表达的刺激作用［J］.复旦学报(医学版)，2011，38(4):343-348.

［26］ 黄 凤，段行武，董建勋，等.益气活血方含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响［J］.环球中医药，2014，7(5):327-332.

［27］ 王 艳，王海萍，吕 洋.中药制剂诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化［J］.中国组织工程研究，2014，18(1):155-160.