快速起搏对家兔心房肌钙通道表达的影响及辛伐他汀的干预研究

章帮助，王联发，陈　晨，黄猛珣

(解放军第一〇五医院心内二科，合肥 230031)

论著

快速起搏对家兔心房肌钙通道表达的影响及辛伐他汀的干预研究

章帮助，王联发※，陈晨，黄猛珣

(解放军第一〇五医院心内二科，合肥 230031)

摘要：目的通过建立快速起搏家兔模型，探讨辛伐他汀对快速起搏早期心房肌细胞L型钙离子通道α1C亚基信使RNA(mRNA)表达的影响。方法30只家兔按随机数字表法分为对照组(n=10)，心房快速起搏组(n=10)和辛伐他汀干预组(n=10) 三组。辛伐他汀干预组予以辛伐他汀5 mg/(kg·d) 灌胃2周，其余组以等量生理盐水灌胃2周，对照组不行起搏，心房快速起搏组和辛伐他汀干预组行快速心房起搏(800次/min)建立家兔快速心房起搏模型，急性起搏8 h后取右心房组织，应用半定量反转录-聚合酶链反应检测心房肌L型钙离子通道α1C亚基mRNA的表达。结果对照组L型钙离子通道α1C亚基mRNA的相对拷贝数为 1.00±0.04，辛伐他汀干预组为0.89±0.04，心房快速起搏组为0.78±0.03。心房快速起搏组和辛伐他汀干预组L型钙离子通道α1C亚基mRNA的相对拷贝数均显著低于对照组(P<0.05)，心房快速起搏组L型钙离子通道α1C亚基mRNA的表达水平低于辛伐他汀干预组(P<0.05)。结论辛伐他汀可以改善家兔快速起搏心房引起的心房肌L型钙离子通道α1C亚基mRNA表达的下降。

关键词:辛伐他汀；快速起搏；L型钙离子通道

心房颤动是指规则有序的心房电活动丧失，代之以快速无序的颤动波，是最严重的心房电活动紊乱之一，可引起心力衰竭、脑卒中等严重的并发症，其防治一直是临床实践中的难点[1]。心房颤动的发病机制较为复杂，深入研究心房颤动的发病机制，寻找安全、有效的防治心房颤动的药物是目前心血管领域的热点。本研究通过建立快速家兔起搏模型，探讨辛伐他汀对快速心房起搏早期心房肌细胞L型钙离子通道α1C亚基信使RNA(mRNA)表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物新西兰大耳白家兔30只(普通级)，合格证号：scxk(苏)2010-0002，购自安徽医科大学实验动物中心，体质量2.0～2.5 kg，雌雄不拘。30只家兔按随机数字表法分为对照组、心房快速起搏组、辛伐他汀干预组，各10只。

1.2药物及试剂①辛伐他汀片(杭州默沙东制药有限公司生产,批号：110782)；②美托洛尔注射液(无锡东方药业生产,批号：EE85)；③阿托品注射液(芜湖市康奇制药有限公司生产，批号：111115)；④RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒 (普洛麦格生物技术有限公司生产，美国)。3%戊巴比妥钠溶液：戊巴比妥钠(上海国药集团生产，批号：20120520)3 g溶解100 mL无菌生理盐水，常温保存。

1.3实验方法

1.3.1快速心房起搏模型的建 立经兔耳缘静脉注射肝素1000 U、 3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)，待兔完全麻醉后将其仰卧固定于兔台(手术过程中根据麻醉情况随时追加戊巴比妥钠)。将固定于兔台的家兔颈部备皮，颈部正中切开3～4 cm长的切口，用血管钳逐层分离皮下组织和肌肉组织，分离并暴露右侧颈内静脉，固定后置入1根5F四极电极导管，插入深度约6 cm至右心房，将导管电极与心电图机电极相连，记录家兔心内膜心电图，当电极位于右心房时心内膜心电图示大A小V，对照组不行快速右心房起搏，心房快速起搏组和辛伐他汀干预组予以心脏电生理刺激仪连续单刺激模式(起搏周长 100 ms，脉宽 0.5 ms，电压 4 V)进行800次/min快速心房起搏刺激8 h，定时观察家兔情况。

1.3.2标本的采集和RNA的提取根据实验分组，辛伐他汀干预组用5 mg/(kg·d)辛伐他汀灌胃2周，其余组以等量生理盐水灌胃2周，分别在起搏8 h后采用空气拴塞法快速处死家兔，无菌技术开胸，迅速取出心脏，在磷酸盐缓冲液中漂洗心脏，取右心房组织充分匀浆，按照Trizol试剂盒操作说明提取总RNA。

1．3.3组织总RNA的质量鉴定紫外分光光度仪测定RNA纯度和浓度，吸光度比值：260/280 nm在1.8～1.9，取1 μL的总RNA溶液在质量分数为1%琼脂糖凝胶中电泳检测，经嗅化乙锭(ethidium bromide，EB)染色后观察RNA质量，28 s与18 s的吸光度比值约为2∶1。

1.3.4引物设计根据要求，在pubmed中查出的基因序列，由上海生工生物公司设计、合成，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增的引物序列及反应条件如下： 3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH),5′-CAGTGGCAAAGTGGAGATTGTTG-3′，5′-CAGTC-TTCTGGGTGGCAGTGAT-3′,55 ℃退火，循环36次，扩增片段长度为491 bp。L型钙离子通道α1C亚基，5′-CAAAGAACCAGCACCAGTACAA-3′，5′-CAGGATGAGAACGAACATCAGA-3′，56 ℃退火，循环36次，扩增片段长度为80 bp。

1.3.5反转录-PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测L型钙离子通道α1C亚基mRNA的表达将1 μg总RNA行反转录反应后所得互补DNA作为模板，行DNA扩增反应。反转录反应(20 μL体系)步骤按照Promage试剂盒操作步骤进行，PCR体系(50 μL)：5 μL互补DNA，25 μL PCR Master Mix，18 μL 无核酶水，上下游引物各1.5 μL。反应产物在质量分数为2%的琼脂糖凝胶上进行电泳并拍照，凝胶成像分析系统对电泳带进行分析，以GAPDH为内参照，测定目的基因和GAPDH扩增产物的吸光度值，将其比值进行统计学分析。

2结果

心房快速起搏组和辛伐他汀干预组L型钙离子通道α1C亚基mRNA的相对拷贝数均显著低于对照组(P<0.05)。心房快速起搏组L型钙离子通道α1C亚基mRNA的表达水平低于辛伐他汀干预组(P<0.05)。见表1、图1。

1：对照组； 2：心房快速起搏组； 3：辛伐他汀干预组； CAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶

图1L型钙离子通道α1C亚基的mRNA产物的琼脂糖电泳结果

CAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶；a与对照组比较,P<0.05;b与心房快速起搏组比较,P<0.05

3讨论

心房重构在心房颤动的发病机制中起重要作用，心房快速激动诱发心房重构的重要因素是细胞内钙超载，钙超载一方面刺激线粒体钙泵摄钙，使胞质内钙向线粒体转移，过多的钙离子与线粒体内含磷酸根的化合物结合成不溶性磷酸钙，引起线粒体代谢异常、ATP生成减少，产生肌小节缺失、肌溶解，导致心房肌结构重构、心房肌收缩功能减退；另一方面，心房肌细胞内钙离子增加负反馈引起钙通道电流密度降低，导致心房电生理重构，进一步引起心房肌兴奋收缩偶联障碍。心肌细胞膜的L型钙通道电流(L-type calcium current,ICa-L)在心房颤动钙超载的过程中起重要作用，研究显示，Ca2+通过L型钙通道的内流是一个多功能的信号，这一过程引发了心肌的收缩，控制动作电位的时程并且能调控基因的表达[2]，动物实验和临床研究认为，心房颤动对心房肌细胞ICa-L具有下调作用[3-4]，同时ICa-L的减少引起动作电位时程缩短及动作电位时程对频率的适应性下降，导致心房颤动的发生，有利于心房颤动的维持[5-6]。研究表明，α1C亚单位[7]为L型钙通道的重要组成部分，可决定钙通道的电压依赖性和药物敏感性，快速心房起搏[8]即可诱导钙超载介导的心房肌L型电压依赖钙通道蛋白α1C亚单位表达下调。周贤惠等[9]发现，房性心动过速时ICa-L电流密度和ICa-L相应α-mRNA 浓度均出现不同程度下降。本实验建立快速心房起搏家兔模型，通过PCR法观察快速心房起搏8 h后L型钙离子通道α1C亚基mRNA变化，电泳结果显示目的基因及内参GAPDH扩增条带位置和理论值相符，快速起搏8 h后心房肌L型钙离子通道α1C亚基mRNA的表达明显下降，证实了快速心房起搏8 h可引起L型钙离子通道转录水平的适应性下调，其机制可能是快速心房起搏早期引起细胞内钙超载负反馈作用的结果，以抑制Ca2+的过度内流，减轻心肌细胞受高浓度Ca2+的损伤。

辛伐他汀为羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂，广泛应用于临床，传统用于阻滞胆固醇的合成、治疗高脂血症。研究认为[10]，他汀类药物具有除治疗高脂血症之外的其他方面的作用，并不依赖于降血脂功能，称之为他汀的多效性。2010 欧洲心脏病协会心房颤动指南[11]指出，通过动物实验证实他汀类药物具有较好的抗心律失常的作用，推荐作为心房颤动一级预防和二级预防(上游治疗)的重要药物。Young等[12]研究发现,他汀类药物服用的时间越长，剂量越大，心房颤动复律后的复发率就越低，说明他汀类药物具有除降血脂、治疗高胆固醇血症作用之外的抗心律失常的作用。Alexander等[13]对29 088例65岁以上急性心肌梗死及冠状动脉血运重建患者的心房颤动发生情况进行分析，他汀组5年和10年心房颤动发生率均低于对照组，此研究也支持他汀类药物预防心房颤动的作用。到目前为止，他汀类药物防治心房颤动的具体机制尚未明确，本研究结果显示，辛伐他汀预处理可以改善快速起搏早期家兔心房肌L型钙离子通道α1C亚基mRNA的表达下降，说明辛伐他汀对快速起搏家兔早期心房肌细胞的保护作用，可能为辛伐他汀防治心房颤动的分子机制之一，为他汀类药物在临床上抗心律失常的应用提供了实验基础。

参考文献

[1]王联发，顾磊.快速起搏对家兔心房肌钙通道表达的影响及螺内酯干预的研究[J].医学综述,2011,17(12):1873-1875.

[2]Shaw RM，Colecraft HM．L-type calcium channel targeting and local signalling in cardiac myocytes[J].Cardiovasc Res，2013，98(2)：177-186.

[3]Grandi E,Pandit SV,Voigt N,etal.Human atrial action potential and Ca2+model:sinus rhythm and chronic atrial fibrillation[J].Circ Res,2011,109(9):1055-1066.

[4]Rose RA,Sellan M,Simpson JA,etal.Iron overload decreases CaV1.3-dependent L-type Ca2+currents leading to bradycardia，altered electrical conduction,and atrial fibrillation[J].Circ Arrhythm Electrophysiol,2011,4(5):733-742.

[5]Chen WJ,Yeh YH,Lin KH,etal.Molecular characterization of thyroid hormone-inhibited atrial L-type calcium channel expression:implication for atrial fibrillation in hyperthyroidism[J].Basic Res Cardiol,2011,106(2):163-174.

[6]Hatem S.Biology of the substrate of atrial fibrillation[J].Biol Aujourdhui,2012,206(1):5-9.

[7]李耀东，汤宝鹏.钙离子通道与老龄心房颤动心房电重构的研究进展[J].心血管病学进展，2011，32(5):718-720.

[8]Kamkin A,Kiseleva I,Theres H,etal.Enhanced L-type calcium currents in cardiomyoeytes from transgenic rats overexpressing SERCA2a[J].Exp Clin Cardiol,2010,15(4)：e109-115.

[9]周贤惠，张健，甘天翊，等.增龄引起犬心房L型电压依赖型钙通道离子重构的分子机制[J].中华心血管病杂志，2012，40(4)：332-337.

[10]王书娟,董金军,王建良.阿托伐他汀对急性心肌梗死后1周兔心室肌细胞L-钙离子通道电流的影响[J].中国医药科学，2011，1(1)：28-30.

[11]Camm AJ,Kirchhof P,Lip GY,etal.Guidelines for the management of atrial fibrillation:the Task Force for the Management of Atrial Fibrillation of the European Society of Cardiology(ESC)[J].Eur Heart J，2010,31(19):2369-2429.

[12]Young XY,Jabbour S,Goldberg R,etal.Usefulness of statin drugs in protecting against atrial fibrillation in patients with coronary artery disease [J].Am J Cardiol,2003,92(12):1379-1383.

[13]Alexander K,Jagmeet S,Raisa L,etal.Association between statin use and the incidence of atrial fibrillation following hospitalization for coronary artery disease[J].Am J Cardiol,2010,105(12):1655-1660.

Influence of Rapid Atrial Pacing on the Expression of L-type Calcium Channel and the Protective Effect of Simvastatin in RabbitsZHANGBang-zhu,WANGLian-fa，CHENChen，HUANGMeng-xun. (DepartmentTwoofCardiology，PLA105thHospital,Hefei230031,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of simvastatin on mRNA expression of atrial α1c subunit of L-type calcium channel on atrial remodeling through establishing rapid atrial pacing rabbit models.MethodsTotal of 30 rabbits were divided into 3 groups according to random number table method：control group(n=10)，rapid pacing group(n=10) and simvastatin group(n=10).Simvastatin 5 mg/(kg·d) was given intragastricaly daily for two weeks before electrophysiology study in simvastatin group,normal saline was given intragastricaly in control and rapid pacing group instead.Control group with no pacing,while in simvastatin group and rapid pacing group,right atrium was paced at 800 beats/min for 8 hours to establish acute atrial fibrillation models,right atrium tissue was obtained for measurement of mRNA expression of α1c subunit of L-type calcium channel by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsIn the control group,the relative copy number of α1c subunit mRNA of L-type calcium channel was 1.00±0.04; 0.89±0.04 in simvastatin group,0.78±0.03 in rapid atrial pacing group.The relative copy number of α1C subunit mRNA of L-type calcium channel in rapid pacing group and simvastatin group were significantly lower than the control group(P<0.05),rapid pacing group lower than simvastatin group(P<0.05).ConclusionPretreatment with simvastatin can improve the degree of mRNA expression of α1c subunit of L-type calcium channel in rapid atrial pacing rabbit models.

Key words:Simvastatin； Rapid atrial pacing； L-type calcium channel

收稿日期：2014-12-29修回日期：2015-05-26编辑：相丹峰

基金项目：南京军区联勤部资助课题(11YG04)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.041

中图分类号：R541.7

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)24-4534-03