mtrR基因突变与淋病奈瑟菌多重耐药的相关性

许志萍，吴爱武

(1. 广州医科大学附属广州市第一人民医院，广东 广州 510180；2. 广州医科大学，广东 广州 510180)

mtrR基因突变与淋病奈瑟菌多重耐药的相关性

许志萍1，吴爱武2

(1. 广州医科大学附属广州市第一人民医院，广东 广州 510180；2. 广州医科大学，广东 广州 510180)

目的了解临床分离的淋病奈瑟菌对常用抗菌药物的耐药性，探讨可传递多重耐药(mtr)系统mtrR基因突变与淋病奈瑟菌多重耐药的相关性。方法采用琼脂稀释法检测30株淋病奈瑟菌临床株对环丙沙星、青霉素、四环素、阿奇霉素、大观霉素和头孢曲松6种临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),同时采用纸片碘量法检测菌株是否产青霉素酶。选取其中仅对1种抗菌药物耐药的临床株和仅对2种抗菌药物同时耐药的临床株以及多重耐药淋病奈瑟菌株提取DNA，采用聚合酶链反应(PCR)扩增其mtrR基因，并将扩增产物测序，比较其与淋病奈瑟菌标准敏感株的差异。结果30株淋病奈瑟菌中仅对1种抗菌药物耐药的有3株(10%)，仅对2种抗菌药物同时耐药的有16株(53%)，对3种抗菌药物同时耐药的有9株(30%)，对4种药物同时耐药的有2株(7%)。30株淋病奈瑟菌的多重耐药率为37%。有7株菌(23%)检出青霉素酶阳性。仅对1种抗菌药物耐药和仅对2种抗菌药物同时耐药的临床株未发现mtrR基因突变；11株多重耐药临床株均有mtrR基因突变，有7株在第45位发生Gly(GGC→GAC)Asp突变,有4株在第51位发生Phe(TTC→GTC)Val突变。结论临床分离的淋病奈瑟菌多重耐药率较高，应持续监测淋病奈瑟菌的耐药性。mtrR基因的第45位Gly(GGC→GAC)Asp突变和第51位Phe(TTC→GTC)Val突变与淋病奈瑟菌的多重耐药密切相关。

淋病奈瑟菌；mtrR基因；多重耐药

近年来，由于抗生素的广泛应用和不合理使用，淋病奈瑟菌的耐药株日益增加，淋病奈瑟菌的耐药尤其是多重耐药已成为淋病防治的一个难点。目前的研究认为，淋病奈瑟菌多重耐药性的产生与可传递多重耐药(multiple transferable resistant，mtr)系统有关，mtr系统对淋病奈瑟菌的多重耐药性的调节机制在转录水平上可分为2种：①mtrR依赖调节机制，该机制中mtrR基因发生突变时使其编码的阻遏蛋白MtrR蛋白合成量减少，对mtrCDE基因的抑制作用减弱，细菌对抗菌药物主动外排的功能增加，引起细菌对多种抗菌药物的广泛耐受。② 非mtrR依赖调节机制，在mtrR基因与mtrC基因之间的启动子区域有一段长13 bp的插入回文结构，当这一回文结构中3’端的最后一个碱基T/A缺失时，会影响mtrR和mtrC基因的表达,从而提高淋病奈瑟菌对抗菌药物的耐药性[1]。并且有研究认为淋病奈瑟菌首先发生mtrR基因的突变，产生对抗菌药物的中度抵抗，接着才发生mtrR基因启动子区域13 bp回文序列单个碱基缺失产生的更高抵抗性[2]。为了进一步探讨淋病奈瑟菌流行株多重耐药的产生与mtrR基因突变的关系，为研究淋病奈瑟菌的多重耐药性及解决其多重耐药问题奠定基础，笔者对临床分离的30株淋病奈瑟菌进行临床常用抗菌药物耐药性检测，并检测这些菌株产青霉素酶的情况，同时对多重耐药菌株进行mtrR基因的检测及序列分析，现将结果报道如下。

1 研究资料

1.1材料

1.1.1实验及质控菌株 30株淋病奈瑟菌均从2013年1—12月广州市第一人民医院性传播疾病(STD)门诊患者的泌尿生殖道分泌物中分离得到。质控菌株为WHO淋病奈瑟菌标准菌株A、B、C、D、E和标准敏感菌株ATCC49226，均购自中国医学科学院皮肤病研究所。

1.1.2主要试剂 GC培养基购自英国OXIOD公司，氧化酶试剂、青霉素酶试剂以及糖发酵试剂均购自法国梅里埃公司。青霉素、四环素、环丙沙星、阿奇霉素、头孢曲松、大观霉素6种抗菌药物购于中国药品生物制品检定所。PCR试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司，基因扩增引物合成、测序均由大连宝生物工程有限公司完成。

1.2方法

1.2.1细菌培养、鉴定及保存 将接种好临床标本的GC培养基置于36 ℃、5% CO2环境下培养24～48 h。挑取圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色菌落，经革兰染色，氧化酶、触酶试验和糖发酵试验确证后，传代培养18～24 h，收集菌株于脱脂牛奶中，置于-70 ℃低温冰箱冰冻保存。

1.2.2最低抑菌浓度(MIC)测定 采用WHO西太平洋地区淋病奈瑟菌耐药监测规划推荐的琼脂稀释法测定[5]。GC基础琼脂高压灭菌，冷却到50 ℃后加入10%新鲜羊血。配制6种抗菌药物原液，再倍比稀释成各种浓度，加入GC血液基础培养基后倾注平板。实验菌株和标准菌株复苏后传代2次，用培养18～24 h的菌苔制成107cfu/mL菌悬液，取1～2 μL菌悬液接种于各种抗菌药物的琼脂平皿上，置于36 ℃、5% CO2培养箱中培养，以WHOA、B、C、D、E标准菌株作质控。24 h后观察结果。在质控菌株均在控的情况下，记录各实验菌株的MIC。按WHO西太平洋地区淋病奈瑟菌耐药监测项目推荐的标准判断结果：环丙沙星、青霉素和头孢曲松MIC≤0.03 mg/L为敏感，0.06～0.5 mg/L为中介，≥1 mg/L为耐药；大观霉素MIC≤64 mg/L为敏感，≥128 mg/L为耐药；阿奇霉素MIC≤0.25 mg/L为敏感，0.5 mg/L为中介，≥1 mg/L为耐药；四环素MIC≥16.1 mg/L为耐药。

1.2.3青霉素酶测定 采用纸片碘量法测定菌株产生的青霉素酶，具体操作：取1支试管，加入10 000 IU/mL的青霉素溶液100 μL、1%淀粉溶液100 μL、碘试剂50 μL，混匀呈蓝色混合物，在一张滤纸条上滴1滴试剂(50 μL)，将一接种环培养物涂在蓝点上，放置1～2 min，如蓝色变成无色即为β-内酰胺酶阳性，颜色无变化则为阴性。每次试验以WHO E株作为阳性对照，A株作为阴性对照。

1.2.4模板DNA制备 将淋病奈瑟菌临床株与标准敏感株接种至GC平板培养18～24 h，挑取1～2接种环的菌苔，重悬于100 μL蒸馏水，进行10 min的温煮后，将其用低温高速离心机12 000 r/min离心10 min，取上清1 μL作为反应模板。

1.2.5PCR扩增mtrR基因 引物参照Lucas设计的序列[3]，由大连宝生物工程有限公司合成。上游引物为5’-GACGACAGTGCCAAfGCAACG-3’,下游引物为5’-GTCGCAGAIACGTTGGAACAACG-3’。扩增条件为预变性95 ℃ 3 min，1个循环，95 ℃变性1 min，退火、延伸60 ℃ 30 s，共36个循环，最后延伸60 ℃ 60 s结束。PCR扩增在美国AB公司出产的荧光PCR扩增仪上完成，其产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外反射透射仪下观察结果。

1.2.6PCR产物纯化与mtrR基因序列测定 对上述扩增产物纯化后用双向测序法测定mtrR基因序列，本步骤由宝生物工程(大连)有限公司协助完成。

2 结 果

2.1淋病奈瑟菌药敏结果 30株临床分离的淋病奈瑟菌中有7株菌(23%)青霉素酶阳性，这些菌株为产青霉素酶淋病奈瑟菌(PPNG)。有10株菌(33%)对四环素耐药，这些菌株是TRNG菌株。实验菌株对环丙沙星、青霉素、四环素、阿奇霉素、大观霉素和头孢曲松的耐药率分别为97%,87%,33%,20%,0,0。30株淋病奈瑟菌中仅对1种抗菌药物耐药的有3株(10%)，仅对2种抗菌药物同时耐药的有16株(53%)，对3种抗菌药物同时耐药的有9株(30%)，对4种抗菌药物同时耐药的有2株(7%)。30株淋病奈瑟菌的多重耐药株(对3种及以上药物耐药)为11株，多重耐药率为37%。

2.2淋病奈瑟菌多重耐药株mtrR基因序列分析 mtrR基因测序结果显示，与标准敏感株ATCC49226比较，仅对1种抗菌药物耐药的3株临床株与对2种抗菌药物同时耐药的3株临床株未发现mtrR基因突变；11株多重耐药临床株均有mtrR基因突变，其中7株发生了第45位Gly(GGC→GAC)Asp,4株发生了第51位Phe(TTC→GTC)Val。其中标准敏感株mtrR基因第45位氨基酸所在的基因序列见图1，标准敏感株mtrR基因第51位氨基酸所在的基因序列见图2，多重耐药株mtrR基因第45位和第51位氨基酸所在的基因序列见图3和图4。其中45位氨基酸发生了G/A的改变，由甘氨酸变成了天门冬氨酸；51位氨基酸发生了T/G的改变，由苯丙氨酸变成了缬氨酸。

图1 标准敏感株 mtrR基因第45位氨基酸所在的基因序列

图2 标准敏感株 mtrR基因第51位氨基酸所在的基因序列

图3 多重耐药株mtrR基因序列第45位Gly(GGC→GAC)Asp

图4 多重耐药株mtrR基因序列第51位Phe(TTC→GTC)Val

3 讨 论

淋病是世界上发病人数最多的性传播疾病之一，随着抗菌药物的广泛应用和不规范用药，淋病奈瑟菌的耐药性越来越严重。淋病奈瑟菌对抗菌药物的耐药性，尤其是多重耐药极大地影响了淋病的治疗效果和预防控制。多重耐药即细菌对3种或3种以上抗菌药物同时耐药[4]，淋病奈瑟菌一旦变成多重耐药菌，临床上可选择的抗菌药物更少，进而大大影响淋病的治愈率。本研究结果显示淋病奈瑟菌多重耐药率达37%，说明本地区淋病奈瑟菌的多重耐药现象占一定的比重，淋病的防治形势不容乐观，临床医生在进行淋病的抗感染治疗时不能仅依靠经验使用抗菌药物，一定要根据实验室的药敏结果选择敏感药物抗感染治疗。

目前的研究认为，淋病奈瑟菌的多重耐药与mtr系统有关。该基因系统由mtrR和mtrCDE基因组成，他们分别编码相应的蛋白质mtrR蛋白和mtrCDE蛋白。mtrR为调节基因，其编码的mtrR蛋白是阻遏蛋白，可以抑制mtrCDE基因的转录；而mtrCDE为结构基因，其编码的mtrC、mtrD、mtrE蛋白细菌细胞膜上，三者形成一个完整的三联体结。当mtrR发生基因缺失或突变时，其编码的 mtrR阻遏蛋白合成减少，使细胞膜上的mtrCDE基因表达增加，从而增加了细胞对疏水性因子(HAs)和各种抗菌药物的外排功能，导致多重耐药的产生[6-8]。

本研究mtrR基因测序结果显示，仅对1种抗菌药物耐药和仅对2种抗菌药物同时耐药的淋病奈瑟菌未发现mtrR基因突变，而多重耐药淋病奈瑟菌均有mtrR基因突变。提示本地区淋病奈瑟菌流行株的多重耐药与mtrR基因突变密切相关，其作用机制可能是mtrR基因突变导致细菌外排系统功能加强，细胞膜通透性降低，从而表现出对环丙沙星、四环素、青霉素和阿奇霉素等多种抗菌药物的耐药。

齐素文等[9]对淋病奈瑟菌mtrR基因突变的研究结果发现，29株中对1种抗菌药物耐药的淋病奈瑟菌只有1株发生了mtrR基因突变，对2种以上抗菌药物耐药的淋病奈瑟菌株均可以检测到mtrR基因的第45位和第105位氨基酸的突变。陈宏翔等[10]检测了10株多重耐药株均有mtrR基因第14位、第45位和第51位氨基酸的突变；而4株敏感株和2株耐青霉素淋病奈瑟菌未发现mtrR基因突变。本研究的多重耐药株只检测到第45位和第51位氨基酸的突变，并未发现第14位、第40位和第105位氨基酸的突变，出现这些差异的原因可能与不同地域的菌株其mtrR基因变异各有其特点有关，说明不同地区在淋病的抗感染治疗方面，因为临床应用的抗菌药物种类、时间、剂量等各有特点，可能导致不同地区淋病奈瑟菌多重耐药基因突变的机制不同，提示在不同地区分别设立淋病奈瑟菌耐药监测点是非常重要的。

[1] 张铁军,周晓明,张涛，等. 淋球菌对阿奇霉素耐药性与mtrR/mtrC基因变异的关联分析[J]. 中国皮肤性病学杂志，2008，22(8)：452-455

[2] 张丽霞,涂亚庭,林能兴,等. 淋病奈瑟菌mtrR基因启动子区的IR区碱基缺失与其耐药性关系的研究[J]. 中国皮肤性病学杂志,2006,20(1):1-3

[3] Lucas CE,Hagman KE,Levin JC,et al. Importance of lipooligosaceharide structure in determining gonocoeeaal resistance to hydrophobic antimicrobial agents resulting from the mtr efflux system[J]. Mol Microbiol,1995,16(5):1001-1009[4] Arias CA，Murray BE. Antibiotic-resistant bugs in zhe 21st century-a clinical super-challenge[J]. N Engl J Med，2009，360(5)：439-443

[5] 曹文苓，黎小东，毕超，等. 某地区淋球菌对6种抗生素耐药性的结果分析[J]. 国际检验医学杂志,2011,32(19):2205-2206

[6] 侯临平，程育春，赵艳霞. 淋球菌多重耐药基因系统研究进展[J]. 实用医技杂志，2011，18(6)：609-610

[7] Warner DM,Folster JP,Shafer WM,et al. Regulation of the MtrC-MtrD-MtrE efflux-pump system modulates the in vivo fitness of Neisseria gonorrhoeae[J]. J Infect Dis,2007,196(12):1804-1812

[8] 袁新亮，康健,林能兴，等. 淋球菌mtrR基因调控区删除突变与淋球菌耐药的关系[J]. 华中科技大学学报:医学版，2012,41(3)：348-352

[9] 齐素文，夏忠弟，邹明祥，等. 淋球菌多重耐药调节基因(mtrR)突变与多重耐药关系的研究[J]. 实用预防医学，2004，11(2)：221-224

[10] 陈宏翔，徐亚庭， 林能兴，等. 淋球菌多重耐药性与mtrR基因点突变的关系[J]. 华中科技大学学报:医学版,2005,34(5):616-621

Correlation between mtrR gene mutation and multi-drug resistant of Neisseria gonorrhoeae

XU Zhiping1, WU Aiwu2

Objective It is to study the drug resistance of Neisseria gonorrhoeae for common antibacterial agents, and to explore the correlation between mtrR system, mtrR gene mutation and multi-drug resistant of Neisseria gonorrhoeae.Methods Agar dilution method was used to detect the minimum bacteriostatic concentration (MIC) of 30 strains of Neisseria gonorrhea clinical strains to 6 kinds of antimicrobial agents commonly used in clinic including ciprofloxacin, penicillin, tetracycline, azithromycin, spectinomycin and ceftriaxone, at the same time penicillin enzyme production was determined by paper iodine volume method. The clinical strains with antimicrobial resistance for one kind of antimicrobial agents, the ones for two kinds and the ones with multi-drug resistance were selected and their DNA was extracted to detect mtrR gene by PCR method, and its differences with Neisseria gonorrhea standard sensitive strains were compared. Results There were 3 clinical strains (10%) with antimicrobial resistance for one kind of antimicrobial agents, 16 ones (53%) for two kinds and 9 ones (30%) for three kinds, 2 ones (7%)for 4 four kinds. The mulit-drug resistance rate was 37%. There were 7 strains whose penicillin enzyme was positive. Gene mutation of mtrR gene was not found in the strains with antimicrobial resistance for one and two kinds of antimicrobial agents, but all the strains with multi-drug resistance had gene mutation, in which 7 strains with Gly(GGC-GAC) Asp mutation on the 45th position, 7 strains with Phe(TTC-GTC)Val mutation on the 51th position. Conclusion Neisseria gonorrhoeae separated in clinic has a high multi-drug resistance rate, and their resistance should be continuously monitored. Gly(GGC-GAC) Asp mutation on the 45th position, Phe(TTC-GTC)Val mutation on the 51th position of mtrR gene are closely related with multi-drug resistance of Neisseria gonorrhoeae.

Neisseria gonorrhoeae; mtrR gene; mulit-drug resistance

许志萍，女，副主任技师，硕士，从事皮肤性病实验室检验工作。

吴爱武，E-mail:aiwwu66@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.28.005

R969.3

A

1008-8849(2015)28-3092-04

2015-01-15

(1. The First People’s Hospital of Guangzhou, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, Guangdong, China; 2. Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, Guangdong, China)