补肾益脑片对加速衰老小鼠脑组织基因表达的影响

张 冲，曹靖晨，王海燕，张永辉，陈苗苗，江 明

(南通大学医学院，江苏 南通 226001)

论 著

补肾益脑片对加速衰老小鼠脑组织基因表达的影响

张 冲，曹靖晨，王海燕，张永辉，陈苗苗，江 明

(南通大学医学院，江苏 南通 226001)

目的探索中药补肾益脑片抗衰老的分子机制。方法使用DDRT-PCR方法研究中药补肾益脑片对加速衰老(SAMR1)小鼠脑组织mRNA表达的影响，观察SAMR1小鼠脑组织基因表达情况。结果发现并克隆了8个受补肾益脑片影响而表达下调的基因片段，分别编码为60S核糖体L21蛋白、164kDa中心体蛋白、泛素特异性蛋白酶14、2型神经营养性酪氨酸受体激酶、海马丰富基因转录物1、Bptf转录因子、X-染色体连锁α地贫/智力低下综合征蛋白和细胞色素C氧化酶亚单位Ⅱ；3个受补肾益脑片影响而表达上调的基因片段，分别编码为线粒体反义RNA、生长激素诱导膜蛋白和葡萄糖-果糖氧化还原酶。这些表达片段多数与已知的衰老相关基因同源。它们在体内涉及能量代谢、信号传导、蛋白质合成与降解、RNA合成与稳定和染色质的重塑等多个方面。结论补肾益脑片以多基因、多靶点、多效应方式发挥其抗衰老作用。

补肾益脑片；抗衰老；脑组织；基因表达

衰老又称为老化，是一种正常而复杂的生物学过程，是所有生物的共同特征，是机体功能退化以及生理功能紊乱的综合表现，是一个不可逆的过程。衰老机制主要与以下3个方面因素有关：①自由基等导致的基因损伤积累效应；②生物钟基因控制的细胞程序衰老；③染色体端粒的缩短与端粒状态的改变。从分子水平来说，均与基因表达水平的改变或基因突变相关[1-3]。快速衰老小鼠(senescence-accelerated mouse,SAM)是由日本京都大学胸部疾病研究所从1970年起开始培育而成，其中的SAMR系小鼠的平均寿命仅为13.3个月，与其他品系小鼠相比存在明显差异。SAM小鼠是目前研究快速衰老的唯一哺乳类模式动物[4]。利用SAM小鼠研究机体衰老的分子机制是目前衰老机制研究的热点之一，其中利用SAMR1研究衰老对无老年性相关病理表型的“正常”老化机制的阐明具有重要意义。而根据传统中医理论配制而成的中药补肾益脑片在抗衰老和改善记忆等方面具有显著效果，但其作用的分子机制仍不清楚。本研究使用信使核糖核酸(messager ribonuclear acids，mRNA)逆转录差异显示聚合酶链式反应 (reverse transcription differential display polymerase chain reaction,DDRT-PCR)的方法，比较了饲喂补肾益脑片的小鼠与对照小鼠脑组织的mRNA表达情况，旨在探讨其作用的分子机制。

1 实验资料

1.1材料

1.1.1实验用补肾益脑片 由牡丹江灵泰药业公司提供。主要成分为鹿茸(去毛)(Cornu Cervi Pantotrichum)、红参(Radix Ginseng)、茯苓(Poria)、山药(炒)(Rhizoma Dioscoreae)、熟地黄(Radix Rehmanniae Preparata)、当归(Radix Angelicae Sinensis)、川芎(Rhizoma Ligustici chuanxiong)、补骨脂(盐制)(Fructus Psoraleae)、牛膝(Radix seu Caulis Epipremni pinnati)、枸杞子(Fructus Lycii)、玄参(Radix Scrophulariae)、麦冬(Herba Ophiopogonis)、五味子(Fructus Schisandrae)、酸枣仁(炒)(Semen Ziziphi Juiubae)、远志(蜜炙)(Polygala tenuifolia Willd.)、朱砂(Cinnabaris)。

1.1.2实验动物及饲喂方式 快速衰老小鼠(SAMR1TA)购自日本京都大学，委托本校实验动物中心饲养。选用2月龄雄性小鼠(体质量18.0～20.0g)，随机分组后采用自由采食方式，12h/12h明暗光周期条件下饲养。实验用饲料：购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心饲料厂的商品化小鼠繁殖料。补肾益脑片经研碎后过100目分样筛，按1%比例加入商品化小鼠繁殖料中。加药饲料由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心饲料厂加工定制。

1.1.3实验用试剂及试剂盒 RNeasy® Mini kit(Qiagen);QIAshredderTM(Qiagen);PCR管(Axygen)；M-MuLV逆转录酶(Biolabs®Inc.)；dNTP(Bebco)；Taq DNA聚合酶(Promga)；α-32p-dCTP(亚辉)；RQ1无RNA酶的DNA酶(Promga)；Rnasin® RNA酶抑制剂(Promga)；尿素(Promga)；糖原(Sigma)；琼脂糖(Biowest)；Wizard® PCR产物纯化系统(Promga)；pGEM®-T Easy 载体系统(Promga)；氨苄青霉素(sigma)；IPTG(Promga)；X-Gal(Promga)；DH5α感受态菌(天威时代)；UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒(SBS)；X射线胶片(Fuji Photo Film Co.Ltd.)；BD MarathonTM cDNA扩增试剂盒(BD Bioscience Clontech);PROTRAN®硝酸纤维素转印膜(Schleicher&Schuell);预杂交及杂交液(上海生物工程技术服务有限公司);随机引物DNA标记试剂盒(TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.)。

1.1.4引物合成 实验用引物由北京赛百盛公司合成。5’端引物：A1为5’-ACAGA GCACA，M2为5’-CACAG TTTGC，M3为5’-CCACA GAGTA，R1为5’-GGAAC TCCGT，R2为5’-GGCAA GTCAC，R4为5’-AGGAC CGCTA；3’端引物：APG为5’-AAGCT TTTTT TTTTT TG，APC为5’-AAGCT TTTTT TTTTT TC，APA为5’-AAGCT TTTTT TTTTT TA。共18个组合。

1.2实验方法

1.2.1总RNA提取 小鼠饲喂3个月后，取试验组与同性别对照组小鼠，断颈处死，撕去头部皮肤，打开头盖骨，取出脑组织。切取大脑左前部(约30mg)，按RNeasy mini Kit操作手册所述方法提取总RNA。并经RQ1RNase-Free DNase处理后备用。

1.2.2RNA逆转录 每个样品取3支PCR管各加入2μL总RNA(1μg)、10×RT缓冲液4μL、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、3'引物2μL、Rnasin®RNA酶抑制剂(40IU/μL)0.5μL，加水至19μL。65℃ 5min，42℃ 10min，每管加入M-MuLV逆转录酶1μL(200IU/μL),37℃ 50min,75℃ 5min。

1.2.3逆转录产物PCR扩增 PCR反应体系：逆转录产物2μL、10×缓冲液2μL、25mmol/L MgCl22μL、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、2μmol/L 5'端引物和3'端引物(SBS合成)各2μL、Taq DNA聚合酶(5IU/μL) 0.4μL、α-32p-dCTP(10μCi/μL) 0.5μL，加水至20μL。PCR反应参数：94℃ 10min；94℃ 1min,40℃ 2min，72℃ 1min，40个循环；72℃ 5min。

1.2.46%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及差异条带的回收再扩增 将1.2.3扩增产物经6%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，X射线片压片，-20℃曝光72h，从凝胶上切取差异条带，加入100μL双蒸水，室温浸泡10min，煮沸15min。离心取上清，加入3mol/L乙酸钠(pH 5.2)10μL，糖原(2.0mg/mL)2.5μL,无水乙醇450μL。-20℃过夜，4℃离心10min，沉淀用冰预冷的85%乙醇洗涤后溶于10μL双蒸水中。再扩增PCR反应体系：回收产物4μL、10×缓冲液4μL、25mmol/L MgCl24μL、2.5mmol/L dNTP 3.2μL、5'端引物(2μmol/L)4μL、3'端引物(2μmol/L)4μL、Taq DNA聚合酶(5IU/μL)0.8μL,加水至40μL。PCR反应参数：94℃ 10min；94℃ 1min,40℃ 2min，72℃ 1min，20个循环；72℃ 5min。94℃ 10min；94℃ 1min,40℃ 2min，72℃ 1min，20个循环；72℃ 5min。

1.2.5再扩增产物的鉴定及纯化 取部分再扩增产物，用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余部分用Wizard® PCR纯化系统进行纯化。

1.2.6纯化产物的连接及转化 将纯化产物连入pGEM®-T Easy载体。转化E.coil DH5α感受态菌。SOC培养基37℃，150r/min，培养1.5h。LB/amp/IPTG/X-Gal平板涂布，37℃培养16h。挑取单个白色菌落，接种LB/amp培养基37℃,150r/min培养过夜。

1.2.7质粒提取及鉴定 取单菌落过夜培养物按UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒使用说明提取质粒DNA，进行PCR扩增，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR反应体系：质粒提取物2μL、10×缓冲液2μL、25mmol/L MgCl22μL、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、5'端引物(2μmol/L)2μL、3'端引物(2μmol/L)2μL、Taq DNA聚合酶(5IU/μL)0.4μL，加水至20μL。PCR反应参数：94℃ 10min；94℃ 1min,40℃ 2min，72℃ 1min，40个循环；72℃ 5min。

1.2.8测序及GenBank检索分析 测序交由上海生工和上海博亚完成。测序结果通过GenBank检索进行同源性比较分析。

1.2.9差异表达片段的Virtual Northern Blot验证 总RNA按BD MarathonTMcDNA扩增试剂盒使用手册所述方法进行逆转录并扩增后电泳。按Sambrook等[5]介绍的方法转印至PROTRAN®硝酸纤维素转印膜，目的片段应用随机引物DNA标记试剂盒进行标记后行杂交分析。

2 结 果

2.1同性别加药与对照的小鼠脑组织材料mRNA DDRT-PCR分析结果 DDRT-RCD得到11个差异条带(见图1)，对其进行再扩增并连接测序。经GenBank检索，显示来自SAMR1试验组的片段(片段p8，p24，p31)分别与小鼠线粒体反义RNA、生长激素诱导膜蛋白mRNA和葡萄糖-果糖氧化还原酶结构域1(Gfod1) mRNA同源；来自SAMR1对照组的片段(p4，p21，p23，p30，p32，p42，p43，p45)分别与60S核糖体

蛋白L21mRNA、164kDa中心体蛋白mRNA(CEP164)、泛素特异性蛋白酶14mRNA、2型神经营养性酪氨酸受体激酶(Ntrk2/TrkB) mRNA、小鼠海马丰富基因转录物1(Hiat1)mRNA、Bptf转录因子(Bptf) mRNA、小鼠X-染色体连锁α地贫/智力低下综合征(Atrx)mRNA、小鼠细胞色素C氧化酶亚单位Ⅱ(Cox2) mRNA同源。经GenBank检索对比的序列同源性结果见表1。

1，2为对照组；3，4为试验组；箭头所示为差异条带。图1 DDRT-PCR部分结果

表1 给药试验序列比较结果

注：p4，p21，p23，p30，p32，p42，p43，p45来源于对照组；p8，p24，p31来源于试验组。

2.2同源基因与衰老相关性检索分析 差异表达基因与衰老相关性检索结果见表2。为验证实验结果的可靠性，对经检索所得的与衰老相关的片段进行标记，进行Virtual Northern blot分析。部分衰老相关片段的Virtual Northern blot结果见图2，其中为a为cDNA用advantage 2PCR kit扩增结果；b为ubiquitin specific protease 14同源片段的virtual northern blot结果。

表2 差异表达基因与衰老相关性检索结果

M为DL2000marker;T为试验组;C为对照组。图2 试验组与对照组间表达变化的部分Virtual Northern blot结果

3 讨 论

衰老是所有生物共有的一种正常而复杂的生物学过程。我国运用中药养生抗衰老源远流长，经验丰富。最早的本草学《神农本草经》中所载“上品”药物120种中就有85种注明有“不老”“长年”“耐老”“增年”“不夭”功效。传统中医理论认为：肾为先天之本，肾虚是促进衰老的首要因素，补肾固生命之元是延年抗衰老的首要方法。补“肾”药能增强机体的生理功能，改善细胞的代谢和营养，改善脑组织功能，调节内分泌，并能提高机体免疫力，增强抗老能力，减缓衰老进程。

补肾益脑片由人参、鹿茸、五味子等16味具有健脾、补肾、益智的中药所配制而成。本研究通过饲喂该药试验，在SAMR1小鼠共获得了11个差异表达片段。经检索发现，多数阳性片段与已知的衰老相关基因同源。

2型神经营养性酪氨酸蛋白激酶(Ntrk2)是脑源性神经营养因子(BDNF)/受体酪氨酸蛋白激酶(Trk)信号通路的主要成员，在老年性疾病阿尔茨海默病的发生发展中起重要作用[11]。Tau蛋白磷酸化改变是阿尔茨海默病的重要病理特征，USP14对Tau蛋白磷酸化起重要作用[9]。补肾益脑片影响脑组织Ntrk2和USP14基因的表达而发挥其抗衰老作用。

细胞凋亡是机体衰老的重要因素之一，生长激素可诱导膜蛋白是Bax抑制蛋白家族成员，而Bax抑制蛋白家族是细胞凋亡的重要调控因子[18]。Cox2也是细胞凋亡信号通路中的关键因素[17]。补肾益脑片影响生长激素可诱导膜蛋白和Cox2的表达而影响细胞凋亡。

能量代谢在衰老进程中处于中心地位，糖类是细胞能量的主要来源，糖类的运输、代谢是细胞能量代谢的基础。线粒体作为细胞的能量供应站而发挥其功能，线粒体呼吸链中Cox2基因的表达变化可直接影响线粒体的呼吸作用而影响细胞的能量供应。补肾益脑片通过影响糖类运输载体Hiat1基因[13]、葡萄糖-果糖氧化还原酶基因(Gfod1)[6，12]和呼吸链中Cox2基因的表达而在抗衰老中发挥作用。

蛋白质是生命活动的基础，细胞蛋白的合成在核糖体进行，核糖体蛋白是核糖体组成的主要组分，核糖体蛋白表达变化直接影响细胞蛋白整体的合成水平。补肾益脑片可影响核糖体蛋白(RPL21)的表达。

RNA是蛋白合成的模板，其转录、加工、成熟、稳定受多种因素的调控。其中，反义调控是其重要调控方式之一。本研究显示，补肾益脑片可影响线粒体反义RNA的表达。

DNA突变及表观遗传学的改变在衰老过程中起着重要作用。Atrx在染色质结构的稳定和功能发挥中起着重要作用[15]，同时也是维持染色体端粒稳定的重要因子[19]。CEP164也是维持基因组稳定的重要因子[8]。而Bptf则通过对组蛋白甲基化状态的改变影响基因的表达。补肾益脑片影响Atrx、CEP164和Bptf基因的表达，进而影响DNA的稳定性成表观遗传的改变而在抗衰老中发挥作用。

本研究结果显示，补肾益脑片可影响多种衰老相关基因的表达。这些基因的表达涉及生命活动的各个方面，包括了从物质运输、能量代谢、蛋白质合成、RNA转录到DNA的稳定和表观遗传学的改变等多层次多环节。这与被广泛接受的中药作用是多靶点、多效应作用的理论相一致，从分子水平上证明补肾益脑片从多个方面参与了机体的抗衰老作用。

[1] Kirkwood TB,Austad SN.Why do we age?[J].Nature,2000,408(6809):233-238

[2] Karlseder J,Smogorzewska A,de Lange T.Senescence induced by altered telomere state, not telomere loss[J].Science,2002,295(5564):2446-2449[3] Jazwinski SM.Longevity,genes,and aging[J].Science,1996,273(5271):54-59

[4] 张冲,程锦雁,陈清轩.动物模型sam小鼠及其在老年医学研究中的应用[J].实验动物科学与管理,2002,19(4):26-34

[5] Sambrook J,Russell DW.Molecular cloning a laboratory manual[M].Cold Spring Harbor.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001

[6] Yap LP,Garcia JV,Han D,et al.The energy-redox axis in aging and age-related neurodegeneration[J].Adv Drug Deliv Rev,2009,61(14):1283-1298

[7] Shirafuji N,Takahashi S,Matsuda S,et al.Mitochondrial antisense rna for cytochrome c oxidase (marco) can induce morphologic changes and cell death in human hematopoietic cell lines[J].Blood,1997,90(11):4567-4577

[8] Sivasubramaniam S,Sun X,Pan YR,et al.Cep164is a mediator protein required for the maintenance of genomic stability through modulation of MDC1, RPA, and CHK1[J].Genes Dev,2008,22(5):587-600

[9] Jin YN,Chen PC,Watson JA,et al.Usp14deficiency increases tau phosphorylation without altering tau degradation or causing tau-dependent deficits[J].PLo S One,2012,7(10):e47884

[10] Reimers K,Choi CY,Bucan V,et al.The growth-hormone inducible transmembrane protein (Ghitm) belongs to the Bax inhibitory protein-like family[J].Int J Biol Sci,2007,3(7):471-476

[11] Chen Z,Simmons MS,Perry RT,et al.Genetic association of neurotrophic tyrosine kinase receptor type 2(NTRK2) with alzheimer's disease[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2008,147(3):363-369

[12] Manini TM.Energy expenditure and aging[J].Ageing Res Rev,2010,9(1):1-11

[13] Matsuo N,Kawamoto S,Matsubara K,et al.Cloning of a cdna encoding a novel sugar transporter expressed in the neonatal mouse hippocampus[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,238(1):126-129

[14] Li H,Ilin S,Wang W,et al.Molecular basis for site-specific read-out of histone h3k4me3by the bptf phd finger of nurf[J].Nature,2006,442(7098):91-95

[15] De La Fuente R,Baumann C,Viveiros MM.Role of atrx in chromatin structure and function: Implications for chromosome instability and human disease[J].Reproduction,2011,142(2):221-234

[16] Strauss KI.Antiinflammatory and neuroprotective actions of cox2inhibitors in the injured brain[J].Brain Behav Immun,2008,22(3):285-298

[17] Pang L,Qiu T,Cao X,et al.Apoptotic role of tgf-beta mediated by smad4mitochondria translocation and cytochrome c oxidase subunit ii interaction[J].Exp Cell Res,2011,317(11):1608-1620

[18] Robinson KS,Clements A,Williams AC,et al.Bax inhibitor 1in apoptosis and disease[J].Oncogene,2011,30(21):2391-2400

[19] Watson LA,Solomon LA,Li JR,et al.Atrx deficiency induces telomere dysfunction, endocrine defects, and reduced life span[J].J Clin Invest,2013,123(5):2049-2063

Effect of the Bushen Yinao tablet on the cerebral tissue gene expression of the senescence-accelerated Mouse R1

ZHANG Chong, CAO Jingchen, WANG Haiyan, ZHANG Yonghui, CHEN Miaomiao, JIANG Ming

(Medical College of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu, China)

Objective It is to explore the anti-senescence molecular mechanism of the traditional Chinese medicine Bushen Yinao tablet.Methods DDRT-PCR was applied to compare the cerebral tissue gene expression of the Senescence-Accelerated Mouse R1(SAMR1) which were treated with traditional Chinese medicine 'Bushen Yinao tablet.Results In the TCM given group, we cloned 8up-expression gene fractions which were 60S ribosomal protein L21, centrosomal protein 164kDa (CEP164), ubiquitin specific protease 14, neurotrophic tyrosine kinase receptor type 2(Ntrk2), hippocampus abundant gene transcript 1(Hiat1), bromodomain PHD finger transcription factor (Bptf), alpha thalassemia/ mental retardation syndrome X-linked homolog (human) (Atrx), cytochrome c oxidase subunit Ⅱ (Cox2), and 3down-expression gene fractions which were Mitochondrial antisense RNA, growth hormone-inducible membrane protein mRNA, glucose-fructose oxidoreductase domain containing 1(Gfod1).Most of those were homologous to the known senescence genes.In organism, they involved in energy metabolism, signal transduction, protein synthesis and Degradation, RNA Transcription and stabilization, and chromatin state remodel, etc.Conclusion This research demonstrated that Bushen Yinao tablet produced its effect with multigene, multiple targets and plurivalent effects in anti-senescence.

Bushen Yinao tablet；anti-senescence; cerebral tissues; gene expression

张冲，男，副研究员，博士，研究方向为中药物质基础及其作用机制。

江苏省高校自然科学基金资助项目(11KJB360009)；南通大学自然科学基金资助项目(10ZY010)；江苏省高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.19.001

R-332

A

1008-8849(2015)19-2053-05

2014-12-15