转录因子E2F1在脑膜瘤中的表达和临床意义

王献明，赵军苍，苏钰清，田云霄，姜树勤

(1.河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001；2.河北省邯郸市传染病医院，河北 邯郸 056002)

转录因子E2F1在脑膜瘤中的表达和临床意义

王献明1，赵军苍1，苏钰清1，田云霄1，姜树勤2

(1.河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001；2.河北省邯郸市传染病医院，河北 邯郸 056002)

目的 研究转录因子E2F1在脑膜瘤中的表达情况及其临床意义。方法 选择57例经病理确诊为脑膜瘤患者及同期行脑外科手术治疗的38例非脑膜瘤患者，应用实时定量PCR方法和Western blot方法定量检测转录因子E2F1在脑膜瘤组织和正常脑膜中的表达情况，并采用免疫组织化学染色方法检测脑膜瘤组织中E2F1蛋白的表达定位。根据E2F1的表达情况分析其与脑膜瘤分型和预后的关系。结果 实时定量PCR结果显示脑膜瘤组织中E2F1 mRNA表达水平显著高于正常脑膜组织，而且恶性脑膜瘤组织中E2F1 mRNA表达高于良性脑膜组织(P<0.01),Western blot结果也证实脑膜瘤组织中E2F1蛋白表达水平显著高于正常脑膜组织(P<0.01)。免疫组织化学染色结果显示脑膜瘤组织中E2F1蛋白主要定位在细胞核中。脑膜瘤组织中E2F1强阳性表达率为65%，正常脑膜组织中E2F1强阳性表达率为10%，二者比较差异具有统计学意义(P<0.01)。不典型和恶性脑膜瘤组织中E2F1强阳性表达率显著高于良性脑膜瘤。3年内脑膜瘤复发组E2F1表达阳性率显著高于无复发组(P<0.01)。结论 E2F1在脑膜瘤组织中表达增强，并且与脑膜瘤的恶性程度和复发率呈正相关。

脑膜瘤;E2F1转录因子;复发;细胞周期

脑膜瘤是颅内常见的肿瘤之一，大多数生长缓慢，病程较长，有部分患者脑膜瘤呈侵袭性生长[1]。脑膜瘤以手术切除治疗为主，大部分患者手术治疗后可获得治愈，但有一部分患者容易复发[2-3]。目前关于脑膜瘤的发生、转移及复发机制尚不清楚，随着分子生物学和基因研究的深入，已经鉴定了多种与脑膜瘤发生发展有关的基因，包括p53、MCM6、EGFR等。研究认为多种基因及多种因素参与了脑膜瘤的发生发展过程，而寻找特异性强和灵敏度高的潜在分子标志物有利于肿瘤的早期诊断和预后分析。E2F1属于E2F转录因子家族中的一员，主要功能是参与细胞周期相关基因表达的转录调节，对细胞周期的进程进行调控[4-6]。研究发现E2F1可能参与了多种肿瘤的发生发展过程，包括食管癌、胃癌、前列腺癌等，并且与肿瘤的侵袭、转移和预后有密切关系[7]。本研究通过实时定量PCR、Western-blot及免疫组织化学染色等方法定量和定性检测了E2F1在脑膜瘤组织和正常脑膜组织中的表达情况，分析了E2F1在脑膜瘤中的表达及与组织病理分型和患者预后之间的关系，旨在为脑膜瘤的诊断和治疗提供参考依据。

1 临床资料

1.1一般资料 选择2004年1月—2008年12月在邯郸市中心医院经病理检查诊断为脑膜瘤的患者57例，男39例，女18例;年龄18～68(34.6±12.8)岁;良性脑膜瘤31例，不典型和恶性脑膜瘤26例;患者均接受手术治疗，术前未接受放化疗、排除心血管疾病和其他肿瘤相关疾病。另选择同期行其他脑外科手术的非脑膜瘤患者38例,男27例，女11例;年龄18～68(34.6±12.8)岁。

1.2 标本采集 手术切除脑膜瘤组织或正常脑膜组织，部分标本经液氮速冻后保存于-80 ℃中，用于RNA提取和蛋白提取实验;部分标本经10%福尔马林固定液固定24h后进行石蜡包埋，用于免疫组织化学检测。

1.3 实时定量PCR检测 脑膜瘤组织及正常脑膜组织采用TRIzol试剂盒(Invitrogen)进行总RNA提取，用TaKaRa的PrimeScript RT Master Mix试剂盒将提取的总RAN反转录成为cDNA。采用Primer Premier 5.0软件进行引物设计。E2F1上游引物为5’- CCCCAACTCCCTCTACCCT- 3’，下游引物为5’- GTCCCCCACTCACCTCTCC- 3’；GAPDH上游引物为5’- GTTGTCTCCTGCGACTTCA- 3’和5’-GGTGGTC CAGGGTTTCTTA-3’。然后根据TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行Real-time PCR反应。具体PCR扩增条件为：95 ℃预变性10 s，40个循环反应：95 ℃变性5 s，60 ℃延伸34s，在60 ℃时采集荧光信号。PCR反应完成后制作融解曲线，并采用∆∆CT法来分析各基因的相对表达差异量，由机器自带软件输出相应的CT值，然后按照∆∆CT法计算：∆∆CT=(CT靶基因-CT内参)处理组-(CT靶基因-CT内参)对照组与对照组相比，靶基因在处理组中相对表达的差异倍数计算公式为：N处理组/对照组=2(-∆∆CT)。

1.4 Western-blot分析 收集脑膜瘤和正常脑膜组织标本，提取总蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品经10%的SDS-PAGE电泳，采用半干电转膜技术将蛋白质转移至硝酸纤维薄膜。室温封闭后，加入一抗为1∶1 000稀释的anti-rabbit E2F1抗体(Santa Cruz)或anti-rabbit GAPDH(Santa Cruz)抗体稀释液，4℃孵育16 h后，TBST洗膜，加入1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(Santa Cruz)，室温下摇床上轻摇1 h后，洗膜。将膜取出，与发光试剂反应，X射线片曝光，避光显影，定影后进行分析，实验重复3次。

1.5 免疫组织化学染色 脑膜瘤组织及正常脑膜组织经10%福尔马林-石蜡包埋后，行组织切片，常规脱蜡至水，切片在枸橼酸钠修复液中微波加热修复10 min，冷却至室温后用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，每次5 min，将切片置于3%过氧化氢15 min消除内源性过氧化物酶，经PBS漂洗后，加入10%马血清37 ℃封闭1 h。用10%马血清配制1∶200的一抗稀释液，4℃孵育过夜。用PBS漂洗3次后，用1% BSA配制的二抗稀释液室温孵育45 min，PBS漂洗3次，加入1% BSA配制的碱性磷酸酶标记的链亲和素，室温孵育30 min用PBS漂洗后，采用DAB显色试剂盒进行显色，待出现棕色信号后，终止显色，苏木精复染后经常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下拍照并进行分析。免疫组织化学染色以细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性表达。图像分析采用OLYMPUS-BX41光学显微镜，每张切片在光学显微镜下随机选择5个视野进行图像采集。

2 结 果

2.1脑膜瘤组织和正常脑膜组织中E2F1的表达 实时定量PCR结果显示，E2F1 mRNA在脑膜瘤组织中的表达显著高于正常脑膜组织(P<0.01)，见图1。非典型和恶性脑膜瘤组织中E2F1 mRNA的表达水平显著高于良性脑膜瘤组织(P<0.001)，见图2。Western blot结果进一步验证了E2F1蛋白在脑膜瘤组织的表达高于正常脑膜组织，见图3。

图1 实时定量PCR检测正常脑膜组织和脑膜瘤组织中E2F1 mRNA的表达

图2 实时定量PCR检测良性脑膜瘤、非典型和恶性脑膜瘤组织中E2F1 mRNA的表达

2.2 脑膜瘤组织和正常脑膜组织中E2F1蛋白的定位 免疫组织化学染色结果显示，在脑膜瘤组织中，E2F1主要表达在肿瘤细胞的细胞核中，见图4；而在正常脑膜组织中，细胞核中E2F1表达较弱，仅可见少量细胞中有E2F1信号，染色较浅，见图5。57例脑膜瘤组织中，E2F1表达阳性37例(65%);38例正常脑膜组织中，E2F1表达阳性4例(10%)，脑膜瘤组织中细胞核E2F1表达阳性率显著高于正常脑膜组织(P<0.01)。

图3 Western blot检测正常脑膜组织和脑膜瘤组织中E2F1蛋白的表达

图4 脑膜瘤组织中E2F1蛋白的表达(40×)

图5 正常脑膜组织中E2F1蛋白的表达(40×)

2.3 E2F1的表达与脑膜瘤分型和预后的关系 31例良性脑膜瘤组织中细胞核E2F1表达阳性18例(58%)，26例不典型和恶性脑膜瘤组织中细胞核E2F1表达阳性19例(73%)，不典型和恶性脑膜瘤组织细胞核E2F1表达阳性率显著高于良性脑膜瘤组织(P<0.01)。分析脑膜瘤组织细胞核中E2F1表达与患者临床特征及预后的关系，结果显示，E2F1表达与脑膜瘤患者的性别和年龄无明显相关性;但3年内有14例患者出现复发性脑膜瘤，其中12例(86%)E2F1表达阳性，显著高于无复发组患者(P<0.01)，见表1。

表1 E2F1表达与脑膜瘤临床特征之间的关系

注：①与无复发比较，P<0.001。

3 讨 论

脑膜瘤是一种常见的颅内肿瘤，约占颅内原发肿瘤的20%，根据WHO颁布的脑膜瘤分型标准可将脑膜瘤分为良性(Ⅰ级)、不典型(Ⅱ级)和恶性脑膜瘤(Ⅲ级)，其病理类型中Ⅰ级脑膜瘤约占90%，Ⅱ级脑膜瘤占4.7%～7.2%，Ⅲ脑膜瘤占1%～3%。脑膜瘤形成占位性病变，头痛、癫痫、视力下降是其最常见的临床症状[8]。手术是脑膜瘤目前主要治疗手段，其他治疗手段包括放疗、化疗、生物治疗，总体预后佳。但部分脑膜瘤可表现为侵袭性生长，手术切除后容易复发，并可发生远处转移，术后脑膜瘤的复发和转移是影响患者预后的关键因素。现阶段大部分的回顾性研究认为Ⅱ级、Ⅲ级脑膜瘤复发率高，病理分级是影响预后的关键，其他预后因素包括年龄、性别、发生部位、治疗方式等。目前关于脑膜瘤的发生发展以及恶性脑膜瘤的形成机制尚未研究清楚。

细胞周期一直是肿瘤研究领域中的热点，正常细胞的增殖和分化受到精密的调控，其中p53和视网膜母细胞瘤(retinal blastoma，RB)家族蛋白是调控细胞周期的关键因子，也是重要的抑癌基因，其表达异常可导致细胞增殖不受控制，从而导致细胞发生致癌性转变[9]。已经在多种人类肿瘤组织中发现p53和RB基因表达异常[10]。E2F家族蛋白作为一类重要的转录因子，普遍存在于高等真核生物中，包括哺乳动物、蠕虫、果蝇和植物等，在进化上具有保守性[11]。在哺乳动物中，已经鉴定出8个E2F转录因子，其蛋白结构主要包括二聚化结构域(dimerization domain)和高度保守的DNA结合域(DNA-binding domain，DBD)。E2F转录因子家族是细胞内重要的调控蛋白，它们通过调节基因组DNA的转录进而调控细胞周期，同时又被细胞周期中一些重要蛋白所调控。因此，在细胞周期信号网络中，E2F家族蛋白发挥着关键性的作用。虽然E2F家族成员的相应基因定位于不同的染色体，但是这些蛋白都包含有高度保守的DNA结合区，与DP蛋白结合的异二聚体区以及与RB蛋白家族成员结合区。E2F蛋白通过二聚化结构域与二聚化(dimerization partner，DP)蛋白形成异源二聚体，从而使E2F/DP能够进入细胞核并获得与特异性DNA序列结合的能力[12]；DBD能够与特异性的DNA序列结合，对靶基因的转录进行调节[13]。E2F转录因子对细胞增殖相关基因的转录调节与RB家族蛋白紧密相关，RB蛋白通过与E2F蛋白的反式激活结构域结合，抑制E2F分子的转录活性[8]。其中E2F1属于激活型E2F转录因子，主要调控细胞周期过程中的G1/S期转换，使细胞进入S期，促进细胞的增殖。当细胞从G1期进入S期时，细胞周期蛋白D(cyclins D)及相关激酶可磷酸化RB，使RB与E2F蛋白分离，从而激活E2F的转录活性，对DNA复制相关基因的表达进行调节。

大量研究表明，E2F1参与了多种肿瘤的发生发展过程。E2F1在胃癌、结肠癌、乳腺浸润型导管癌组织中表达均上调，过表达E2F1后可使细胞增殖活性增强，并诱导肿瘤细胞的形成[9]。本研究结果显示，在脑膜瘤组织中，E2F1mRNA和蛋白水平明显高于正常脑膜组织，并且不典型或恶性脑膜瘤组织中E2F1的表达水平显著高于良性脑膜瘤组织，说明E2F1可能参与了脑膜瘤的发生过程。在静止期细胞中，E2F1与RB蛋白结合，并以失活状态存在于细胞质内，激活后可进入细胞核而发挥转录因子的活性。有研究显示与正常脑膜组织相比，脑膜瘤组织中RB蛋白表达缺失[16]。本研究结果显示脑膜瘤组织中E2F1蛋白主要定位在细胞核内，因此在脑膜瘤发生过程中，RB蛋白表达缺失后，对E2F1蛋白的抑制作用消失，E2F1可进入细胞核，通过调控细胞周期相关基因的表达而促进细胞增殖，从而促进脑膜瘤的发生和发展。根据脑膜瘤临床分型的结果发现E2F1在不典型或恶性脑膜瘤组织细胞核中的阳性表达率显著高于良性脑膜瘤。另外，脑膜瘤组织细胞核中E2F1的表达阳性率与患者的性别和年龄无明显关联，但3年内复发组脑膜瘤患者中肿瘤细胞核中E2F1表达阳性率显著高于无复发组，进一步证实了E2F1可能参与了脑膜瘤的发展，并且与脑膜瘤的恶性行为有关。

综上，转录因子E2F1可促进脑膜瘤的发生和恶性转变，临床上检测E2F1的表达对判断脑膜瘤的恶性程度具有辅助指导意义，并可作为预测患者是否复发的指标之一。

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Expression and clinical significance of transcriptional factor E2F1 in meningiomas

WANG Xianming1, ZHAO Juncang1, SU Yuqing1, TIAN Yunxiao1, JIANG Shuqin2

(1.The Central Hospital of Handan, Handan 056001,Hebei, China; 2.The Infectious Disease Hospital of Handan, Handan 056002, Hebei, China)

Objective It is to observe the expression of transcriptional factor E2F1 and its clinical pathological significance in meningiomas.Methods 57 cases of meningiomas tissues diagnosed by pathological examination were included in this study, 38 cases of normal meninges tissues were used for control.Real-time PCR and Western blot were adopted for the quantification of E2F1 expression in meningiomas, immunohistochemistry was used to detect the E2F1 protein localization in meningiomas.The potential role of E2F1 in tumor classification and prognosis were analyzed.Results Real-time PCR results showed that E2F1 mRNA level was significantly higher than normal meninges tissues.Western blot results showed that E2F1 protein level was significantly higher than normal meninges tissues (P<0.01).Immunohistochemistry results revealed that E2F1 protein was mainly localized at nuclei meningiomas (P<0.01).The positive expression rate of E2F1 in meningiomas was 65 %, which was significantly higher than normal meninges tissues (P<0.01).In addition, the positive expression rate of E2F1 in atypical and malignant meningiomas was 73%, which was significantly higher than benign meningiomas (P<0.01).The positive expression rate of E2F1 in meningiomas recurrence group were markedly higher than non recurrence group (P<0.01).Conclusion E2F1 is highly expressed in meningiomas, and is positively correlated with malignancy grade and recurrence of meningiomas.

meningiomas; transcriptional factor E2F1; reoccurrence; cell cycle

王献明，男,副主任医师，研究方向为神经外科。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.09.008

R739.45

A

1008-8849(2015)09-0936-04

2014-10-15