商陆皂苷甲对BXSB小鼠狼疮肾炎凋亡的影响

马华林，张祥贵，杨 丹，孟令国

(1.广东省深圳市人民医院,广东 深圳 518020；2.遵义医学院第五附属医院，广东 珠海 519100)

商陆皂苷甲对BXSB小鼠狼疮肾炎凋亡的影响

马华林1，张祥贵2，杨 丹2，孟令国2

(1.广东省深圳市人民医院,广东 深圳 518020；2.遵义医学院第五附属医院，广东 珠海 519100)

目的 通过观察商陆皂苷甲(EsA)对BXSB小鼠肾脏细胞凋亡的影响，探讨EsA对狼疮肾炎的作用机制。方法 将24只18周龄雄性BXSB小鼠随机分为模型组、地塞米松组和EsA组，腹腔注射相应药物治疗4周后留取肾组织标本，采用原位末端标记法检测肾脏细胞凋亡情况，免疫组化检测组织中Bax、Bcl-2、Fas、FasL表达情况。结果 ①3组间肾小球和肾小管细胞的凋亡指数差异有统计学意义(P<0.05)，EsA组凋亡指数最高，其次为地塞米松组。②与模型组比较，两治疗组小鼠肾组织Bcl-2光密度值显著下降(P<0.05)，EsA和地塞米松治疗组间无统计学差异(P>0.05)；3组间Bax的表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；而3组间肾组织Bcl-2/Bax的比值比较差异有统计学意义(P<0.05)。③与模型组比较，两治疗组BXSB小鼠的肾组织Fas、FasL 光密度值明显增加(P<0.05)，EsA和地塞米松治疗组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EsA具有诱导BXSB小鼠肾小球和肾小管细胞凋亡作用,其通过下调BXSB小鼠肾组织中Bcl-2表达及上调Fas、FsaL表达而促进细胞凋亡的发生。

商陆皂苷甲；狼疮肾炎；细胞凋亡

细胞凋亡过程是在一系列相关基因的有序调节和控制下进行的,而在参与细胞凋亡调控的相关基因中,目前研究较清楚的有Bcl-2家族、ced家族、Fas和p53等。目前认为，狼疮肾炎(LN)的发生发展与肾脏细胞增殖和凋亡失衡关系密切，表现为细胞数量的异常增多，而细胞凋亡呈现绝对或相对不足，致使细胞增殖占据优势[1]。商陆皂苷甲(EsA)是从商陆块根中提取的含量最高的皂苷[2],有其可能具有诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖等多种功效[3]。本实验通过动物模型观察了EsA对LN肾脏细胞凋亡的影响并探讨其作用机制，现报道如下。

1 实验资料

1.1 实验动物 选用系统性红斑狼疮模型BXSB小鼠24只，雄性，体质量(28±2)g，鼠龄18周，北京大学医学部免疫学教研室提供。

1.2 动物分组 将24只小鼠编号按随机数字表法分为模型组、地塞米松组及EsA组,每组8只。

1.3 药品试剂 EsA粉剂(西安文阳贸易有限公司生产，批号：65497076)。地塞米松磷酸钠注射液(广州白云山制药股份公司生产，1 mL/5 mg国药准字H44022091)。

1.4 干预方法 模型组腹腔注射，RPMI1640培养液0.2 mL/d，地塞米松组腹腔注射地塞米松溶液1 mg/(kg·d)，EsA组腹腔注射EsA溶液20 mg/(kg·d)。每只小鼠均给药1次/d，连续4周，终点为小鼠22周龄。

1.5 标本采集 乙醚麻醉后，处死小鼠，切开腹腔摘取肾组织，固定后石蜡包埋。将肾组织石蜡标本连续切成4μm，60 ℃烘干后，4℃存储备用。

1.6 免疫组化法检测 采用链霉素亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(SABC法)检测BXSB小鼠肾组织Bax、Bcl-2、Fas、Fasl表达情况。Imagepro-plus 6.0软件分析各组图像，镜下随机取10个无重叠视野(×400倍视野)，相同的光强度下检测出每个视野的Bax、Bcl-2、Fas、FasL累积光密度(IOD)及检测面积(Area)，按照IOD/Area计算比值，即平均光密度值，该比值越大阳性表达越强，反之阳性弱。

1.7 TUNEL法检测 通过原位末端标记法即TUNEL法检测肾脏细胞凋亡情况。每切片均在10×40倍视野下随机选取10个无重复的肾小球或肾小管，计数每个肾小球或肾脏内阳性细胞数以及固有细胞总数，以两者比值计为凋亡指数。

2 结 果

2.1 各组BXSB小鼠肾脏细胞凋亡情况 TUNEL阳性细胞在各组的肾组织中均可见到，主要存在于肾小管上皮细胞和肾小球内细胞。模型组的肾小球和肾小管凋亡指数最低，其次是地塞米松组，EsA治疗组最高。组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 各组肾小鼠小球及小管细胞凋亡指数比较

注：①与模型组比较，P<0.05；②与地塞米松组比较，P<0.05。

2.2 各组BXSB小鼠肾组织Bax Bcl-2表达及Bcl-2/Bax情况 各组肾组织中Bax、Bcl-2均有表达，肾小球内细胞有少量表达，表达主要位于小管上皮细胞。EsA组和地塞米松组Bcl-5肾小管上皮细胞和肾小球内细胞EsA组和地塞米松组表达与模型组比较均有所减弱。半定量结果显示3组间Bax表达比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。而EsA组和地塞米松组肾组织Bcl-2光密度值明显低于模型组(P<0.05)，EsA组和地塞米松组比较差异无统计学意义(P<0.05)。EsA组和地塞米松Bcl-2/Bax明显低于模型组，EsA组低于地塞米松组。见表2。

表2 各组肾组织Bax、Bcl-2及Bcl-2/Bax光密度值比较

注：①与模型组比较，P<0.05;②与地塞米松组比较，P<0.05。

2.3 各组BXSB小鼠肾组织Fas和FasL表达情况 Fas和FasL蛋白在各组肾组织中均有表达，肾小球细胞和肾间质细胞胞浆均可见Fas和FasL表达，地塞米松和EsA组肾小球内和肾间质细胞阳性表达较模型组均有所增强。与模型组比较，地塞米松组和EsA组Fas和Fas L光密度值明显上升(P<0.05)；地塞米松组和EsA组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠肾组织Fas和FasL光密度值比较

注：①与模型组比较，P<0.05。

3 讨 论

本研究经TUNEL法检测后发现地塞米松组和EAS组的肾小球和肾小管细胞凋亡指数较对照组明显升高，且地塞米松组的效果与王建中等[4]的研究结果基本一致，表明EsA具有类似于地塞米松的诱导肾脏细胞凋亡作用。

既往的研究发现，相对于LN患者肾组织中细胞的过度增殖，细胞凋亡明显显得不足，而Bcl-2在LN活动期肾小球内高表达且与肾小球的增殖程度呈正相关，可以推测凋亡不足可能与Bcl-2的过度表达有关[5]。本研究结果显示：相比于模型组，地塞米松组和EAS组肾组织Bcl-2光密度值明显下降,提示EsA可能具有类似于激素(地塞米松)的作用，可通过下调Bcl-2，从而诱导LN细胞凋亡。Bax与Bcl-2正好相反，是Bcl-2家族中重要的促凋亡调节基因[6]，因此,Bax 和Bcl-2的比例可以决定细胞凋亡敏感性[7]。本研究结果显示：相比于模型组，地塞米松组和EsA均对肾组织Bax表达无明显影响。然而，结合各组Bcl-2∕Bax比值，可以推测EsA可能通过下调Bcl-2表达及Bcl-2∕Bax比值而非直接上调诱导凋亡蛋白Bax的表达发挥诱导细胞凋亡作用。

在自身免疫性疾病的肾脏损害中，Fas/FasL 系统也受到广泛关注[8-9]。Fas、FasL在肾小球和肾小管间质细胞中均有表达，但在肾小球和肾小管间质细胞的表达程度有所不同。Fas介导的死亡受体途径在LN的发病过程中起了一定的作用[10]，当Fas或FasL基因表达缺陷或改变时，使模型小鼠出现狼疮发病或使病情加重，在MRL/lpr[11]或MRL/gld[12]小鼠中均已证实；同样在LN患者肾组织中也发现小球细胞和小管间质细胞中有Fas、FasL表达[13]。而本研究结果显示：相比于模型组，两地塞米松组和EsA组小鼠的肾组织Fas、FasL光密度值明显增强，这说明实验剂量的EsA可能具有地塞米松类似的作用，可通过上调肾小球细胞和/或肾间质细胞Fas、FasL蛋白的表达，从而改善LN病情。

综上所述，EsA具有促进BXSB小鼠肾脏细胞凋亡作用。随着凋亡紊乱在系统性红斑狼疮发病作用研究中的进一步深入，凋亡调节剂的运用具有重要的治疗前景。

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Effect of esculentoside A on apoptosis of lupus nephritis-prone BXSB mouse

MA Hualin1, ZHANG Xianggui2, YANG Dan2, MENG Lingguo2

(1.Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020, Guangdong, China; 2.The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zhuhai 519100, Guangdong, China)

Objective It is to observe the effects of esculentoside A (EsA) on the renal cell apoptosis of BXSB mouse, and explore the mechanism of ESA on Lupus nephritis.Methods 24cases of male BXSB mice at the age of 18 weeks were randomly divided into model group, EsA group and Dexamethasone group.The BXSB mice were treated by Sodium Chloride, ESA and Dexamethasone.Four weeks later, all mice were killed to obtain nephridial tissue.The apoptosis ratio of nephros cells was detected by in situ end labeling method, the expression of Bax, Bcl-2, Fas and FasL in nephridial tissue were detected by Immunohistochemical method.Results ①There was significant difference in apoptosis index of nephros cells among three groups (allP<0.05).The apoptosis index of EsA group was highest and Dexamethasone group was following.②The expression of Bcl-2 in kidneys of model group was significantly higher than that of EsA and Dexamethasone group (P<0.05); there was no significant difference between EsA and Dexamethasone group(P>0.05).There was no significant difference in the express of Bax among three groups (allP>0.05).There was significant difference among there groups in the ratio of Bcl-2/Bax (allP<0.05).③The expression of Fas and FasL in kidneys of model group was significantly lower than that of EsA and Dexamethasone group (P<0.05), there was no difference between EsA and Dexamethasone group (P>0.05).ConclusionEsA can degrade urine protein concentration and improve renal function, pathological kidney damage in BXSB mice.EsA can promote the apoptosis of nephros cell, and down regulation the expression of Bcl-2 and up regulation the expression of Fas and FasL in BXSB mice.

esculentoside A; lupus nephritis; cell apoptosis

马华林，男，主治医师，从事肾脏病的临床与基础研究工作。

张祥贵，E-mail: zxg5220@163.com

遵义医学院珠海校区科研启动基金项目(KY200607)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.09.005

R-332

A

1008-8849(2015)09-0927-03

2014-10-30