GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌中的表达及临床意义

杨学丽，路三军，魏 娉，桂红武，安 欣，姜琳娜，尹 峰

(河北省邯郸市第一医院，河北 邯郸 056002)

GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌中的表达及临床意义

杨学丽，路三军，魏 娉，桂红武，安 欣，姜琳娜，尹 峰

(河北省邯郸市第一医院，河北 邯郸 056002)

目的 探讨GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌中的表达情况及其临床意义。方法 采用免疫组织化学S-P方法分别检测79例患者近端胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜组织的GSK-3β、DKK-1、β-catenin表达情况，并分析其临床意义。结果 GSK-3β在近端胃癌组织的表达比癌旁组织及正常胃黏膜组织表达量明显降低(P均<0.05)，GSK-3β阳性表达率与TNM分期、分化程度、肌层浸润程度、淋巴结转移显著相关(P均<0.05)。DKK-1在近端胃癌的表达比癌旁组织及正常胃黏膜的表达量均明显升高(P均<0.05)，DKK-1 阳性表达率与TNM分期、分化程度、肌层浸润程度显著相关(P均<0.05)。β-catenin在近端胃癌中细胞质及细胞核的异常表达比癌旁组织及正常胃黏膜的异常表达均明显升高(P均<0.05)。GSK-3β的表达与DKK-1的表达及β-catenin的异常表达呈负相关(P均<0.05)。结论 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌的发展、侵袭和转移中起重要作用，可作为近端胃癌诊断和判断预后的指标。

近端胃癌;GSK-3β;DKK-1;β-catenin

胃癌(gastric carcinoma，GC)是我国乃至世界最常见的恶性肿瘤之一，因其侵袭性强和易于转移而位居癌症致死原因的前列[1]。近年来研究表明，近端胃癌与其他部位胃癌无论是发病人群、手术方式、预后等均有不同，已知幽门螺杆菌诱导性胃炎所致的胃酸下降可导致远端胃癌的发生[2]，而近端胃癌发病机制尚不明确。DKK-1(Dickkopf-1)、糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、β-catenin均是参与Wnt 肿瘤信号通路的重要成分，本研究拟采用免疫组织化学方法测定三者在不同部位胃癌组织中的表达情况，并结合临床病理因素，分析它们在近端胃癌发生发展中的作用。

1 研究资料

1.1 材料

1.1.1 标本来源 取自邯郸市第一医院病理科2013—2014年提供的近端胃癌标本79例，同时收集胃癌组织、癌旁组织(距肿物2 cm) 和正常胃黏膜组织(距肿物5 cm以上)，经10%福尔马林固定、常规石蜡包埋、切片并经2名资深病理科医生确诊。患者参照WHO 推荐的分级分化标准，高分化腺癌9例，中分化鳞癌59例，低分化腺癌11例。其中男62例，女17例；年龄18～85(56.4±5.3岁)。每例均有详细的临床资料，术前均未进行化疗及放疗。所有患者的标本采集符合伦理学规定并得到认可，且患者签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂 兔抗人GSK-3β( BS1402) 多克隆抗体购自美国Bioworld Technology 公司，兔抗人DKK-1 多克隆抗体购自美国Santa Cruz 生物技术公司，兔抗人β-catenin 多克隆抗体、S-P免疫组织化学试剂盒及DAB 显色剂均购自福州迈新生物技术公司，光学显微镜和Olympus DP70 图像采集系统来自日本Olympus 公司。

1.2 实验步骤 取近端胃癌组织的石蜡包埋标本，制成4 μm 厚度连续切片，常规脱蜡，微波修复抗原，3%过氧化氢溶液以阻断内源性过氧化物酶活性。正常山羊血清封闭，分别滴加一抗为兔抗人GSK-3β( BS1402) 多克隆抗体、兔抗人DKK-1 多克隆抗体(1∶100)和兔抗人β-catenin多克隆抗体(1∶100)，37 ℃孵育2～3 h后依次滴加山羊抗兔二抗，辣根酶标记链霉卵蛋白素。DAB 显色，苏木精复染，脱水、透明、封固。以上实验以PBS 代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。

1.3 结果判定标准 依据染色细胞比例和染色强度进行综合评分。在高倍光镜下(×200) 挑选5 个视野，每个视野计数200个细胞。①GSK-3β 阳性信号主要定位在细胞质，染色分级标准为不表达或<30%细胞表达为0分，阳性细胞数30%～50%为1分，阳性细胞数51%～70%为2分，阳性细胞数>70%为3分。0～1分视为阴性，2～3分为阳性。②DKK-1主要在细胞质与细胞核表达，根据染色程度评分：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。将细胞染色程度计分与阳性百分数计分相加即为综合评分，积分为0～2分表示阴性(-)，3～4分为阳性(+)，5～6分为强阳性()，后两者均视为阳性表达。③β-catenin染色分级标准为细胞膜表达减少或基本消失为0分，细胞质或细胞核表达为1分，异质性表达减弱为2分，保留细胞膜的表达为3分。0～2分为异常表达，3分为正常表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0软件包进行统计学分析。样本率的比较采用卡方检验，并将3个不同指标行Speraman相关分析，α=0.05作为统计学检验显著性水准，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜组织中的表达情况 在近端胃癌组织、癌旁组织和正常胃黏膜组织中均有GSK-3β、DKK-1、β-catenin的表达。GSK-3β主要位于细胞质(见图1)，近端胃癌组织比癌旁组织及正常胃黏膜组织表达量均明显降低(P均<0.05)；DKK-1在近端胃癌、癌旁组织和正常胃黏膜中均有表达，主要位于细胞质(见图2)，近端胃癌比癌旁组织及正常胃黏膜的表达量均明显升高(P均<0.05)。β-catenin在近端胃癌、癌旁组织和正常胃黏膜中均有细胞质及细胞核的异常表达(见图3)，近端胃癌比癌旁组织及正常胃黏膜的异常表达均明显升高(P均<0.05)。各指标具体表达情况见表1。

图1 GSK-3β在近端胃癌组织中的表达(SP法，×400)

图2 DKK-1在近端胃癌组织中的表达(SP法，×400)

图3 β-catenin在近端胃癌组织中的异常表达(SP法，×400)

表1 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜组织中的阳性表达 例(%)

2.2 GSK-3β、DKK-1与近端胃癌组织临床病理特征的关系 GSK-3β阳性表达率与TNM分期、分化程度、肌层浸润程度、淋巴结转移显著相关(P均<0.05)，与性别、年龄无明显相关性(P均>0.05)；DKK-1 阳性表达率与TNM分期、分化程度、肌层浸润程度显著相关(P均<0.05)，与性别、年龄、淋巴结转移无明显相关性(P均>0.05)。见表2。

表2 GSK-3β、DKK-1达与近端胃癌组织临床病理特征的关系 例

2.3 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌组织中表达的相关性 在79例近端胃癌中，GSK-3β与DKK-1的阳性表达与β-catenin的异常表达呈显著负相关(r=-0.545，P<0.05)。

3 讨 论

在当今的医疗检查设备条件下, 近端胃癌被发现时通常正处于进展期，而且由于解剖部位的特殊性，近端胃癌患者的肿瘤还时常浸润组织,造成淋巴结转移，导致近端胃癌患者治疗困难，预后差。WHO把其归类于食管胃交界腺癌，指肿瘤完全位于食管胃交界下方，未侵及食管。

分子生物学研究发现，Wnt/β-catenin信号传导通路在细胞增殖、分化以及迁移等方面起着重要的调控作用，β-catenin与GSK-3β是Wnt经典信号通路的2个重要调节因子[3]。GSK-3β是这一信号转导途径中重要的调节分子，它与APC和Axin 形成复合体，使β-catenin N 端丝氨酸/苏氨酸磷酸化引起β-catenin 降解，从而调节β-catenin的细胞内含量、定位和功能[4]。本研究结果显示，GSK-3β在近端胃癌组织中的表达比癌旁组织及正常胃黏膜组织表达量明显降低，并与β-catenin的异常表达呈显著负相关，表明GSK-3β的低表达可能促进近端胃癌细胞的增殖，与其发生密切相关。同时，GSK-3β阳性表达率与TNM分期、分化程度、肌层浸润程度、淋巴结转移显著相关，提示GSK-3β与肿瘤的侵袭和转移相关，与文献[5]报道一致。

DKK-1 是一种分泌型糖蛋白，属于DKK家族成员，是一种有力的Wnt信号途径拮抗剂。DKK-1 通过诱导形成一种三元复合物产生内吞作用，发挥抑制功能，造成Wnt 经典信号传导途径阻断，从而诱导体内多种肿瘤细胞发生凋亡[6-7]。本研究结果显示，DKK-1在近端胃癌中的表达比癌旁组织及正常胃黏膜的表达量明显升高，与本研究组前期研究结果一致[8]；同时研究显示，DKK-1 阳性表达率与TNM分期、分化程度、肌层浸润程度显著相关。多种肿瘤中Wnt/β-catenin 信号通路被抑制是由于APC 或者β-catenin 改变而引起DKK-1 在人类细胞中的表达[9]，由此构成了一个负反馈回路，这可能是胃癌中DKK-1 表达增加的原因。Lee等[10]对胃癌患者组织及血清DKK-1表达进行研究发现，胃癌组血清DKK-1浓度明显高于健康对照组，肿瘤组织中DKK-1高表达与血清DKK-1高浓度具有相关性，本研究结果与其一致。然而有研究认为胃癌组织中DKK-1的表达下调[11]。故DKK-1在胃癌组织中的表达与胃癌发生的部位是否具有相关性尚需要进一步研究。

本研究结果显示，在正常胃组织和癌旁组织中，β-catenin均呈膜表达，而在近端胃癌组织中β-catenin呈胞浆及胞核表达，并与DKK-1的表达呈正相关，与GSK-3β的表达呈负相关，提示三者在近端胃癌的发展、侵袭和转移中起重要作用，可作为近端胃癌的诊断和判断预后的指标。然而肿瘤的发生发展是多因素、多阶段改变的复杂过程，该途径中多种因子变化的机制尚不完全明确，还需要进一步研究。

[1] 邹小农,孙喜斌,陈万青,等. 2003-2007 年中国胃癌发病与死亡情况分析[J]. 肿瘤,2012,32(2):109-114

[2] Silberg DG,Swain GP,Suh ER,et al. Cdx1 and Cdx2 expression during intestinal development[J]. Gastroenterology,2000,119(4):961-971

[3] Gu S,Honisch S,Kounenidakis M,et al. Membrane androgen receptor down-regulates c-Src-activity and Beta-catenin transcription and yriggers GSK-3β-phosphorylation in colon tumor cells[J]. Cell Physiol Biochem，2014,34(4):1402-1412

[4] George B，Vollenbreker B，Saleem M A，et al. GSK3β inactivation in podocytes results in decreased phosphorylation of p70S6K accompanied by cytoskeletal rearrangements and inhibited motility[J]. Am Physiol Renal Physiol,2011,300(5):F1152-1162

[5] Carotenuto M,De Antonellis P,Liguori L,et al. H-Prune through GSK-3β interaction sustains canonical WNT/β-catenin signaling enhancing cancer progression in NSCLC[J]. Oncotarget,2014,5(14):5736-5749

[6] Tsai JF,Jeng JE,Chuang WL. Dickkopf-1 and hepatocellular carcinoma[J]. Lancet Oncol,2012,13(10):e410

[7] Rawson JB，Manno M，Mrkonjic M，et al. Promoter methylation of Wnt antagonists DKK1 and SFRP1 is associated with opposing tumor subtypes in two large populations of colorectal cancer patients[J]. Carcinogenesis,2011,32(5):741-747

[8] 路三军，杨学丽，桂洪武，等.近端胃癌中DKK-1和β-catenin的表达及其相关性[J].中国肿瘤临床,2013,40(1):1038-1041

[9]TakahashiYF,KahnM.TargetingWntsignaling:canwesafelyeradicatecancerstemcells[J].ClinCancerRes,2010,16(12):3153-3162

[10]LeeHS,LeeHE,ParkdoJ,etal.ClinicalsignificanceofserumandtissueDickkopf-1levelsinpatientswithgastriccancer[J].ClinChimActa,2012,413(21/22):1753-1760

[11]SatoH,SuzukiH,ToyotaM,etal.FrequentepigeneticinactivationofDICKKOPFfamilygenesinhumangastrointestinaltumors[J].Carcinogenesis,2007,28(12):2459-2466

Expression of GSK-3β, DKK-1 and β-catenin in proximal gastric cancer and their clinical significance

YANG Xueli, LU Sanjun, WEI Ping, GUI Hongwu, AN Xin, JIANG Linna, YIN Feng

(The First Hospital of Handan City, Handan 056002, Hebei, China)

Objective It is to investigate the expression of GSK-3β, DKK-1 and β-catenin in proximal gastric cancer and their clinical significance. Methods The expression of GSK-3β, DKK-1 and β-catenin were detected in pathological tissue sections of proximal gastric cancer tissues, para-neoplastic tissues and normal gastric mucosa from 79 patients with gtastric cancer by immunohistochemical SP method. Their clinical pathological features were analyzed statistically. Results The expression of GSK-3β in the proximal gastric cancer were significantly lower than that in the para-neoplastic tissues and the normal gastric mucosa (allP<0.05). The positive expression rates of GSK-3β were related with tissue differentiation, TNM clinical stage, myometrial invasion and lymph node metastasis (allP<0.05). The expression of DKK-1 in the proximal gastric cancer were significantly higher than that in the para-neoplastic tissues and the normal gastric mucosa (allP<0.05). The positive expression rates of DKK-1 were related with tissue differentiation, TNM clinical stage, myometrial invasion (allP<0.05). The abnormal expression of β-catenin in the para-carcinoma tissues were significantly higher than that in the para-neoplastic tissues and the normal gastric mucosa (allP<0.05). The expression of GSK-3β has significantly negative correlation with the expression of DKK-1 and the abnormal expression of β-catenin (allP<0.05). Conclusion GSK-3β, DKK-1 and β-catenin play an important role in the development, invasion and metastasis of proximal gastric cancer. They can be used as an index of diagnosis and prognosis of proximal gastric cancer.

proximal gastric cancer; GSK-3β; dickkopf-1; β-catenin

杨学丽，女，硕士研究生，主治医师，从事胃肠道疾病病理诊断工作。

路三军，E-mail:lusanjun211@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.24.008

R735.2

A

1008-8849(2015)24-2646-04

2015-02-10