大鼠胶原诱导关节炎应用来氟米特的时间治疗学研究

李凤霞，徐 萍，叶 青，曹小燕，郑建国，张育红，付 坤

(湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000)

大鼠胶原诱导关节炎应用来氟米特的时间治疗学研究

李凤霞，徐 萍，叶 青，曹小燕，郑建国，张育红，付 坤

(湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000)

目的 探讨来氟米特(LEF)不同给药时间对大鼠胶原诱导关节炎的治疗效果和对炎性细胞因子的影响。方法 取6只大鼠作为空白组，其余造模后第15天加强免疫后关节炎指数>5的24只成模大鼠随机分为模型组、LEF7时组、LEF19时组，每组8只。LEF7时组于7:00、LEF19时组于19:00分别灌胃LEF5mg/(kg·d)，模型组及空白组分别给予等量生理盐水，均灌胃28d。对比观察各组胶原诱导关节炎模型炎症评分、外周血肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平及骨质破坏情况。结果 给药后LEF7时组、LEF19时组关节炎指数、关节肿胀度均明显低于给药前及模型组(P均<0.05)，LEF19时组有高于LEF7时组趋势，但2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。LEF7时组、LEF19时组外周血TNF-α、IL-6水平均低于模型组(P均<0.05);LEF19时组TNF-α和IL-6水平有高于LEF7时组的趋势，但2组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。各组胶原诱导关节炎大鼠关节均出现明显的骨质破坏，且模型组骨质破坏更明显。结论LEF不同时间给药对大鼠胶原诱导关节炎及其炎性细胞因子的影响可能存在差异，且可能延缓骨质破坏。

胶原诱导关节炎;来氟米特;时间治疗学;SD大鼠

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因未明的多系统性自身免疫性疾病，晨僵是其特征性表现之一[1]。近年来有报道采用时间治疗学给予泼尼松治疗RA比传统的给药方式更有效[2-3]。来氟米特(LEF)作为重要的改变病情抗风湿药(disease-modifying antirheumatic drug，DMARD)之一，使用越来越广泛，它能有效控制炎症，为大量RA患者带来福音。但是LEF作为治疗RA的一线改变病情抗风湿药尚缺乏在时间治疗学方面的研究。RA患者血液中炎症细胞因子存在昼夜时间节律，并与晨僵症状一致[4-5]。因此认为，采用时间生物学策略，根据患者炎性细胞因子的昼夜节律时间给药可能比传统临床给药治疗效果更佳。最先的动物模型发现，大鼠胶原诱导关节炎(CIA)具有与RA患者相似的病理、免疫学、遗传学和炎性细胞因子特征[6-7]。因此，本研究在建立大鼠CIA模型的基础上，观察了不同时间应用 LEF对CIA模型炎症评分及血清肿瘤坏死因子-α( TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、关节影像学的影响，旨在探讨LEF是否存在时间治疗学效应。

1 实验资料

1.1实验动物 SD大鼠50只，雌雄各半，清洁级，体质量(160±20)g，毛色纯白，购自湖北医药学院实验动物中心，实验动物生产许可证：SCXK(鄂)2011-008；实验动物使用许可证：SYXK(鄂)2011-0031。 将大鼠放置时间生物学实验室，固定光照(L)∶黑暗(D)时间(12∶12，明期7:00—19:00，暗期19:00—7:00，室温(21±2)℃，相对湿度(50±10)%，自由食水，适应1周后进行实验。

1.2 实验试剂及材料 牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)；LEF，由苏州-长征欣凯公司惠赠；大鼠血清TNF-α、IL-6试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。主要仪器:手持式匀浆器(德国FLUKO)，Wellscan MK3酶标仪(芬兰)，超低温冰箱(中国海尔)，游标卡尺(中国)。

1.3 CIA大鼠模型的建立

1.3.1 免疫混合物的制备 将牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂4 ℃冰箱过夜，将二者按1∶1体积比例混合，使用手持匀浆器5 000 r/min充分乳化，制成含牛Ⅱ型胶原1 mg/mL的完全弗氏佐剂(FCA)乳化液，现配现用。

1.3.2 模型复制 采用游标卡尺检测大鼠双后足踝关节直径后，取6只作为空白组外，其余均于尾根部常规皮肤消毒，用微量注射器皮内注射FCA 0.2 mL/只；14 d后加强免疫，于尾根部不同部位皮内注射FCA 0.1 mL/只。空白组大鼠给予同等剂量的生理盐水皮内注射，方法同上。

1.4 分组与实验步骤 造模后第15天，将加强免疫后关节炎指数(arthritis index，AI)>5的24只成模大鼠随机分为模型组、LEF7时组、LEF19时组，每组8只。LEF7时组于7:00、LEF19时组于19:00分别灌胃LEF 5 mg/(kg·d)，模型组及空白组分别给予等量生理盐水，均灌胃28 d。给药前后测定大鼠后足踝关节肿胀度、AI和大鼠关节摄片。末次给药后，于次日8:00将大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100g) 腹腔注射麻醉后，经股动脉采血，分离血清备检。

1.5 大鼠关节肿胀度和AI评定 采用游标卡尺测量大鼠后足踝关节肿胀度:大鼠固定器固定大鼠后，将待测后肢以胫骨下端内踝处为解剖标志点，用游标卡尺测量右后踝关节左右直径。AI评定按5级评分法评价：0分为无红肿；1分为有红色斑点或轻度肿胀;2分为关节中度肿胀；3分为关节重度肿胀；4分为关节强直甚至畸形，严重功能障碍。每爪4分,共计16分,6～8分为严重关节炎。AI=四肢关节评分之和。

1.6 关节影像学评定 每只大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g) 腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，将四肢伸展固定，留取X射线影像学资料，观察关节破坏情况。于初次免疫前、初次给药前、末次给药后留取大鼠关节影像学资料，进行动态观察和组间比较。影像学破坏分级标准，Ⅰ期:无破坏性改变，可见骨质疏松；Ⅱ期:骨质疏松，可有轻度的软骨破坏，有或没有轻度的软骨下骨质破坏，可见关节活动受限,但无关节畸形；Ⅲ期:骨质疏松加软骨或骨质破坏，关节畸形，如半脱位、尺侧偏斜，无纤维性或骨性强直；Ⅳ期:纤维性或骨性强直。

1.7 血清TNF-α、IL-6的检测 采用ELISA法测定，严格按试剂盒要求进行操作:取出试剂盒，各试剂平衡至室温(20～25 ℃)。取出酶标板，按次序分别加入标准品溶液或待测样品100 μL于空白微孔中，空白对照加入100 μL样品稀释液。37 ℃孵育90 min，弃液、甩干。在各孔中加入100 μL酶标记溶液(不含空白对照孔)，将酶标板密封，37 ℃避光孵育60 min，洗板3次，用吸水纸拍干。各孔加入100 μL ABC工作液，37 ℃避光孵育30 min，洗板5次，用吸水纸拍干。各孔加入底物溶液90 μL。37 ℃下避光孵育10～15 min。每孔加入50 μL终止液，终止反应。根据OD值，由酶标仪编程直接得出浓度值。

2 结 果

2.1各组大鼠足肿胀度及AI比较 给药给药28 d后,LEF7时组、LEF19时组AI、关节肿胀度均明显低于给药前及模型组(P均<0.05)，LEF19时组有高于LEF7时组趋势，但2组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠足肿胀度及AI比较

注:①与给药前比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较 模型组血清TNF-α、IL-6水平均高于空白组(P均<0.05);LEF7时组、LEF19时组外周血TNF-α、IL-6水平均低于模型组(P均<0.05);LEF19时组TNF-α和IL-6水平有高于LEF7时组的趋势，但2组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

2.3 各组大鼠关节影像学表现 除空白组外，其余组大鼠关节均出现明显的骨质破坏，给药28 d后模型组关节破坏较LEF7时组、LEF19时组更明显。见图1。

3 讨 论

近年来，国内外学者对RA的发病机制、临床表现和药物治疗的时间生物学研究表明，昼夜节律在 RA的疾病过程中起着重要作用，对指导临床医生转变RA的治疗策略产生重要影响。虽然LEF目前已广泛应用于临床治疗RA，但仍有部分患者疗效欠佳或因LEF不良反应停药，猜测可能与未合理服用LEF有关，如剂量不足或给药时间不合理等。

表2 各组大鼠血清细胞因子水平比较

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

图1 各组给药前后大鼠关节影像学表现

LEF是一种新型免疫调节药物，口服后经肠壁和肝脏迅速转化为活性代谢产物A771726,能抑制细胞黏附和酪酸激酶的活性[8],通过抑制二氢乳酸脱氢酶的活性,阻断嘧啶的合成,减少炎症因子的产生,从而发挥抗炎和免疫抑制作用。由于LEF与血浆蛋白结合，血浆半衰期长达15～18 d，因此其给药间隔时间、昼夜给药最佳时间等的研究对提高临床疗效和减少毒副作用具有实际意义。

To等[9-10]先后经动物实验和临床研究发现，根据RA炎性细胞因子的昼夜节律给药，睡前服用甲氨蝶呤(MTX)的时间疗法与常规用药法相比可更有效改善RA的临床症状。本研究结果显示,采用夜间给药和晨起给药2种方式治疗大鼠CIA均有效，但7：00给药和19：00给药各指标比较差异均无统计学意义，仅提示7：00给药疗效可能优于19：00给药。大鼠为昼伏夜出的哺乳动物，24 h昼夜节律不同于人类，本研究间接提示夜间给药可能改善人类应用LEF治疗RA疗效，这与国外关于其他改变病情抗风湿药时间治疗学研究结果存在一定相似性。本研究采用大鼠CIA模型，结果与国内LEF采用时间治疗学方法治疗大鼠佐剂关节炎(AIA)模型研究结果存在一定差异[11]，推测可能与给药时间点和给药周期不同有关,同时CIA和AIA 2种模型根据昼夜节律给药并未获得如糖皮质激素和甲氨蝶呤夜间给药的更大收益，推测可能与LEF半衰期长有关。

由于本研究未设计临床研究，只能根据实验结果推测LEF可能存在时间治疗学效应，但要确定LEF治疗RA的最佳给药时间，尚需进一步开展针对临床试验、更多给药时间点的时间药效学、不同给药间隔时间、时间毒理学以及时间药代动力学、滑膜病理学等相关研究。

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Research on leflunomide chronotherapy in treatment of collagen-induced arthritis in rats

LI Fengxia, XU Ping, YE Qing, CAO Xiaoyan, ZHENG Jianguo, ZHANG Yuhong, FU Kun

(The People’s Hospital Affiliated to Hubei Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to investigate the therapeutic effect of leflunomide (LEF) by different administration time in rats with collagen-induced arthritis (CIA) and its influence on inflammatory cytokines. Methods 6 rats were selected into the control group, and the others were used to establish the models of CIA, and 24 successful models were randomly divided into model group, group A and group B with 8 cases in each groups. LEF was given at 07:00 in group A and 19:00 in group B respectively, and equal dose of physiological saline was given in control group and model group. Gastric administration lasted 28 days. Then the changes of inflammation scores, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) levels of peripheral blood in all groups were observed, and the X-ray changes of joints were observed too. Results The arthritis indexes (AI) and joint swelling degree were significantly decreased in the group A and group B after treatment (allP<0.05), and there was significant difference compared with model group (allP<0.05), there was a trend of that in group A was lower than that in group B, but there was no significant difference between group A and group B (allP>0.05). Compared with model group, the levels of TNF-α, IL-6 in peripheral blood were significantly decreased in group A and group B (allP<0.05), there was a trend of that in group A was lower than that in group B, but there was no significant difference between group A and group B (allP>0.05). Bone destruction and loss were observed in all rats of CIA, and the bone destruction in model group was the most obvious. Conclusion The influence of LEF administration at different time on CIA and inflammatory cytokines in rats may be different. LEF may be prevented bone destruction in CIA rats.

collagen-induced arthritis; leflunomide; chronotherapeutics; SD rat

李凤霞，女，住院医师，硕士研究生，主要从事风湿免疫系统疾病的研究和临床工作。

徐萍，E-mail:shyxup@sina.com

十堰市科技局科技计划项目(201320)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.24.004

R-332

A

1008-8849(2015)24-2632-03

2014-05-10