HPLC-ELSD法测定养血饮口服液中黄芪甲苷的含量

隆旭红，金文丽

（嘉峪关市食品药品检验所，甘肃 嘉峪关 735100）

HPLC-ELSD法测定养血饮口服液中黄芪甲苷的含量

隆旭红，金文丽

（嘉峪关市食品药品检验所，甘肃 嘉峪关 735100）

目的探讨用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定养血饮口服液中黄芪甲苷含量的方法。方法 采用Sinochrom ODS-AP（4.6×250mm，5μm）色谱柱，梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为水，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量20μl；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度45℃，压缩空气压力350 kPa。在以上条件下测定养血饮口服液中黄芪甲苷的含量。结果在本色谱条件下，黄芪甲苷与其他峰分离良好，在54.18～866.80μg/ml（R2=0.999 1）的范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率为101.3%，RSD为0.88%（n=9）。结论 HPLC-ELSD法准确度高、专属性强，可用于养血饮口服液中黄芪甲苷的含量测定。

高效液相色谱-蒸发光散射检测法；养血饮口服液；黄芪甲苷

养血饮口服液是由黄芪、当归、鹿角胶、阿胶等制成的，具有补气养血、益肾助脾之功效，主治气血两亏、崩漏下血，体虚羸弱、血小板减少及贫血，对放疗和化疗后引起的白细胞减少也有一定的治疗作用。方中的黄芪为君药，黄芪甲苷为其主要指标成分和有效成分之一，能够增强机体免疫力、提高机体抗病能力，具有抗病毒作用，还能增强细胞生理代谢作用，促进血液循环，亦可改善心肺功能。本文参考相关文献[1-10]，经过方法学的论证结果表明，高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）简便、准确、重现性好，可以作为黄芪质量控制的方法，并具有广泛的应用价值。

1 仪器与试药

LC-20AT高效液相色谱仪；ELSD-LT II低温型蒸发光散射检测器;METTLER MS205DU电子天平；乙腈（色谱纯）；水为超纯水；黄芪甲苷对照品（批号：110781-200613，中国食品药品检定研究院）；市售养血饮口服液（批号：130451，生产厂家：山东步长制药股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Sinochrom ODS-AP（4.6×250mm，5μm）；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B；流速：1.0 m l/min；柱温30℃，漂移管温度45℃；压缩空气压力350 kPa；进样量20μl，在以上条件下进行梯度洗脱，程序见表1。理论板数应不低于4 000。

表1 梯度洗脱程序

2.2 对照品储备液的制备

将黄芪甲苷对照品置于盛有五氧化二磷的减压干燥器中干燥12小时后，精密称取21.67mg，置于10m l量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀备用。

2.3 对照品溶液的制备

精密量取上述对照品储备液5.0m l置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.4 供试品溶液的制备

精密量取养血饮口服液20.0 m l，置于锥形瓶中，加甲醇50 m l超声提取30分钟，取出，冷却，过滤，用甲醇洗涤滤纸并沉淀两次，每次5 m l，水浴蒸干，残渣加5%氯化钠溶液30 m l使溶解，加用水饱和的正丁醇，并提取3次，每次30m l，合并正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 m l量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.5 线性关系的证明

取上述对照品溶液，分别取样 5μl、10μl、20μl、40μl、60μl、80μl，记录色谱图，以浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程。Y=1.02×107X-66 820（r=0.999 5，n=6），表明浓度与峰面积在 54.18～866.80μg/ml的范围内呈良好的线性关系。

2.6 检出限与定量限

精密量取上述对照品储备液，用甲醇逐级稀释后取20μl在上述色谱条件下测定，记录色谱图，并对色谱系统进行基线检测。分别以信噪比3∶1和10∶1确定检出限和定量限，检出限为 5.40μg/ml，定量限为 18.00μg/m l。

2.7 精密度实验

精密量取上述对照品溶液20μl，连续进样5次，记录色谱图，以峰面积计算，RSD为1.20%（n=6）。结果表明仪器的精密度良好，见表2。

表2 精密度测定结果

2.8 加样回收率实验

取已测得黄芪甲苷含量的同一批号（130451）的养血饮口服液，精密量取9份，每份20.0ml，3份为一组，分别精密加入对照品储备液0.4ml、0.5ml、0.6ml，即按对照品溶液浓度的80%、100%、120%配制，置于盛有样品的锥形瓶中，按“2.4”项制备，在上述色谱条件下，按外标法以峰面积计算回收率，平均回收率为101.3%，RSD为0.88%（n=9）。实验结果表明，本法有良好的回收率。

2.9 稳定性实验

取上述对照品溶液，按上述色谱条件，于0小时、2小时、4小时、8小时、12小时进样，记录色谱图。结果峰形无改变，峰面积的RSD为0.71%，说明对照品溶液在12小时内稳定。

2.10 重复性实验

选取市售同一批号（130451）的养血饮口服液，精密量取5份，每份20.0m l，按“2.4”项制备。分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算黄芪甲苷的含量，结果分别为：0.582 mg/支、0.601mg/支、0.594mg/支、0.587mg/支、0.603 mg/支，RSD为 0.96%（n=5）。

3 讨论

3.1 流动相的选择

参考《中国药典》2010年版一部黄芪的含量测定，其流动相为乙腈-水（32∶68），在实际实验中，色谱的峰形不好，且峰面积不稳定；采用乙腈-水（45∶55）为流动相时，出峰太快，样品中黄芪甲苷与其他峰分离不好。经过反复实验，本文采用梯度洗脱，保证了分离度和理论板数符合要求。

3.2 漂移管温度和压缩空气压力的选择

由于本文采用的是低温型蒸发光散射检测器，在40℃、45℃、50℃进行实验，最后确定在45℃时峰形好、出峰时间稳定、峰面积稳定；压缩空气压力经过反复调节、实验，最后确定在（350±5）kPa。

3.3 计算方法的选择

本文经过一系列方法学论证，证明线性关系良好，可以采用外标法以峰面积计算样品的含量。

3.4 样品的预处理

本文采用的提取方法能够将黄芪甲苷提取完全，在样品测定时受其他成分影响较小。

3.5 检测方法

由于黄芪甲苷在紫外区只有末端被吸收，若采用HPLCUV法检测，效果不好；若采用薄层扫描法，其操作复杂，稳定性、重复性相对较差，方法误差较大且组分干扰严重。故本文采用HPLC-ELSD法进行检测。

3.6 养血饮口服液中黄芪甲苷的含量测定

可采用 Sinochrom ODS-AP（4.6×250 mm，5μm）色谱柱，梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为水，流速1.0m l/min，柱温30℃，进样量20μl；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度45℃，压缩空气压力350 kPa。在以上条件下测定养血饮口服液中黄芪甲苷的含量。

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G424.31

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1671-1246（2015）16-0082-03