HPLC考察燕窝加工前后唾液酸的含量变化

卓丹如阙慧卿林绥章宁钱丽萍林善财

（1福州瑞来春堂生物科技有限公司，福建 福州 350001；2福建省医学科学研究院）

HPLC考察燕窝加工前后唾液酸的含量变化

卓丹如1阙慧卿2林绥2章宁1钱丽萍2林善财1

（1福州瑞来春堂生物科技有限公司，福建 福州 350001；2福建省医学科学研究院）

目的：建立燕窝中唾液酸的分离分析方法，考察燕窝原料（去除杂质的干燥燕窝）、炖煮和加工成即食罐头前后唾液酸的含量变化。方法：燕窝经过磷酸水解，使唾液酸（即N-乙酰神经氨酸）从唾液酸糖蛋白的结合状态游离，用高效液相色谱法测定唾液酸的含量，应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》评价燕窝3种样品的指纹图谱，比较3种样品的唾液酸含量变化。结果：燕窝原料的唾液酸含量为9.898%，经炖煮或加工成即食罐头后，唾液酸的含量分别为9.921%，9.913%，略高于原料。结论：燕窝加工成即食罐头后其唾液酸含量与直接炖煮的接近，略高于燕窝原料，提示应用现代工艺将燕窝加工成即食罐头，唾液酸保存较好。

燕窝原料；炖煮燕窝；燕窝即食罐头；唾液酸（N-乙酰神经氨酸）；高效液相色谱法；中药色谱指纹图谱相似度评价

燕窝为雨燕科（Apodidae）金丝燕属（Collocalia）动物金丝褐雨燕及多种同属燕类用唾液或唾液与绒羽等混合凝结所筑成的巢窝。目前市场上销售的燕窝以屋燕为主，主要规格为白燕盏或称龙牙盏。燕窝始载于《本草逢原》，其性味甘、平，归心、肺、肾经，具有养阴润燥，益气补中的功效，临床可用于治疗虚损，痨瘵，咳嗽痰喘，咯血，吐血，久痢，久疟，噎膈反胃等症，向以贵重药材及美味佳肴而在民间广为流传使用，是宜药宜膳的高级保健品[1]。燕窝的传统使用方法基本是由使用者自行购买后炖煮食用，使用不方便，因为没有明确的操作规范，极大地影响了燕窝的生物利用。随着中药现代化技术在中药与保健食品行业的渗透，将燕窝加工成即食罐头，越来越受到消费者的青睐。对燕窝罐头中主要成分的保存和燕窝罐头的质量控制等提高燕窝的生物利用度的研究具有重要意义。

燕窝主要成分按含量高低依次为蛋白质、碳水化合物、灰分和油脂[2]，其中糖蛋白为主要成分，唾液酸由糖蛋白唾液酸、氨基酸和糖构成，胡国昌等[3]发现在 100℃、2 h的提取条件下，唾液酸的提取量约为总量的50%，唾液酸为糖蛋白的指标成分。本文应用高效液相色谱法（HPLC）测定燕窝加工前后唾液酸的含量，应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》评价样品的指纹图谱，初步考察燕窝加工前后的物质基础变化情况以及燕窝加工成即食罐头后主要成分唾液酸的稳定性，通过分析唾液酸的保存情况，为探讨燕窝即食罐头加工工艺的可行性提供参考依据。

1 仪器和试药

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）；LC-20A紫外检测器（日本岛津）；数显恒温油浴锅（金坛市江南仪器厂）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

唾液酸标准品（又名N-乙酰神经氨酸，纯度≥99%，购自Sigma公司）；磷酸：分析纯，水：新制超纯水。燕窝原料（福州瑞来春堂生物科技有限公司提供，原产地为马来西亚，批号：110701），燕窝即食罐头（福州瑞来春堂生物科技有限公司提供,原料原产地为马来西亚，批号：110701）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm），紫外检测器，流动相为0.05%磷酸水溶液，流速为0.5 m L／min，检测波长为 192 nm，进样体积为20μL。

2.2 对照品溶液的制备

取唾液酸标准品适量，加超纯水制得0.48mg/m L的对照品溶液。

2.3 样品溶液的制备[4]

燕窝原料供试液制备：将燕窝干燥至恒重，研磨粉碎成粗粉，精密称取约0.05 g各 5份，分别置于100 m L具塞锥形瓶中，精密加入1.0%磷酸40 m L，称定质量，浸泡2.0 h，于沸水中水解20 m in，不时轻轻摇动三角瓶，避免燕窝粉末挂壁。水解后迅速冷却至室温，补足减失质量，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜过滤，制得供试品溶液5份。

燕窝即食罐头样品供试液制备：倒出罐头燕窝干燥至恒重，研磨粉碎成粗粉，精密称取约0.10 g粗粉（除去糖等辅料 0.049 8 g，约相当于燕窝原料0.05 g），分别置于100 m L具塞锥形瓶中，精密加入1.0%磷酸40 m L，称定质量，浸泡2.0 h。于沸水中水解20 m in，不时轻轻摇动三角瓶，避免燕窝粉末挂壁。水解后迅速冷却至室温，补足减失质量，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜过滤，制得供试品溶液5份。

燕窝炖煮样品供试液制备：将燕窝干燥至恒重，研磨粉碎成粗粉，精密称取约0.05 g各5份，分别置于40 m L具塞锥形瓶中，精密加入超纯水20 m L，称定质量，浸泡2.0 h，于沸水中炖煮15 m in，不时轻轻摇动三角瓶，避免燕窝粉末挂壁。水解后迅速冷却至室温，补足减失质量，准确加入2.0%磷酸20 m L，称定质量，于沸水中水解20 m in，水解后迅速冷却至室温，补足减失质量，摇匀，用 0.45μm的微孔滤膜过滤，制得供试品溶液5份。

2.4 线性关系考察

精密称取唾液酸标准品适量，加水溶解制成4 mg/m L对照品储备液。吸取上述储备液，配制成0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 mg/m L等一系列浓度的对照品溶液。分别精密吸取20μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：

Y=6×107X＋ 106（r=0.999 5）。

2.5 进样精密度试验

取2.4项下的唾液酸对照品溶液（0.2 mg/m L），重复进样测定6次，其RSD为0.60%，显示精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一份样品溶液，分别于0，2，4，6，8，10 h测定其峰面积，RSD为0.78%，表明该样品溶液至少在10 h内稳定。

2.7 重复性试验

精密称取燕窝粗粉6份，按燕窝原料的处理方法处理后进样，结果RSD为1.05%，表明该方法重复性较好。

2.8 最低检测限

取唾液酸对照品溶液适量，加水并逐步稀释，用液相色谱仪记录其峰高及信噪比，信噪比为3时，唾液酸的最低检测限为0.01 mg/m L。

2.9 加样回收试验

采用加样回收法，精密称取已测定含量的燕窝原料约50 mg（共 6份），分别精密加入唾液酸对照品储备液10 m L，按燕窝原料的处理方法处理后进样测定，计算加样回收率。结果平均回收率为96.82%（n=6），RSD为1.20%，符合含量测定的有关技术要求。

3 测定

精密吸取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算各样品中唾液酸的含量，通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，比较3个样品的指纹图谱，计算相似度。色谱图见图1，结果见表1，相似度匹配图谱见图2，相似度见表2。

4 结果

从HPLC图数据分析可知，燕窝经炖煮或加工成即食罐头后唾液酸的含量均大于9.9%，略高于燕窝原料。燕窝原料、炖煮燕窝和燕窝即食罐头主成分出峰时间一致，其余几个成分的出峰时间基本相同，HPLC图差别不大。以燕窝原料指纹图谱为参照谱图，比较炖煮燕窝和燕窝即食罐头与原料的异同，结果两种加工后样品的指纹图谱与原料的指纹图谱相似，相似度分别为0.990和0.989，与生成的参照指纹图谱相似度为0.997。

图1 各种燕窝与对照品HPLC图

表1 燕窝的唾液酸含量

图2 各种燕窝相似度指纹图谱

表2 燕窝相似度

5 讨论

燕窝传统的食用方法是清洗过后用食用水浸泡2 h，再炖煮15 m in，本实验炖煮燕窝也采用了传统炖煮方法，先用20 m L的超纯水浸泡2 h，炖煮15min，补足减少的质量后，加2%的磷酸20m L，配成燕窝中磷酸的浓度为1.0%。称定质量，于沸水中水解 20 m in，水解后迅速冷却至室温，补足减失质量，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜过滤，进样。为了实验的平行，燕窝原料与燕窝即食罐头干燥粗粉也相应地浸泡2小时处理。燕窝即食罐头先干燥至恒重，去除糖分等辅料的含量，得出100 g罐头粗粉相当于燕窝原料0.050 2 g，为了使实验具有可比性，确定称取约100 mg罐头粗粉（相当于燕窝原料0.05 g）进行试验，并比较实验结果。

本文利用HPLC对燕窝中的唾液酸含量进行研究，参考文献[6]的实验方法开展实验，测出唾液酸的含量在9%左右。将燕窝原料、经炖煮品及加工成即食罐头后唾液酸的含量进行比较，结果发现燕窝炖煮或加工成即食罐头后唾液酸含量均高于燕窝原料直接测定，这可能是即食罐头燕窝中糖分等高渗透性物质的存在，促进了燕窝的浸润，使唾液酸的溶出增加，含量略高于燕窝原料；炖煮燕窝的唾液酸含量高于原料，初步推断是其在酸解前先用超纯水炖煮了15分钟，然后在溶液状态下直接酸解，造成唾液酸充分溶出有关。

另外，实验数据显示炖煮燕窝的唾液酸含量也略高于即食罐头的唾液酸含量，也是由于燕窝即食罐头是经干燥后，扣除了糖分等辅料，干燥粗粉直接进行浸泡酸解，然后测定唾液酸；而炖煮燕窝是经炖煮，燕窝充分溶解后进行浸泡酸解、测定。

燕窝炖煮和加工成即食罐头后，样品的指纹图谱与燕窝原料的指纹图谱极其相似，相似度分别为0.990和0.989，与生成的参照指纹图谱相似度为0.997，提示两种加工方法所得燕窝唾液酸指纹图谱与燕窝粗制品及两种加工品的指纹图谱极其相似，加工后样品的物质基础与原料相同。

燕窝传统的食用方法是炖煮，炖煮燕窝可以很好地将其中的主要活性成分充分溶解出来，但炖煮食用对条件要求比较高，影响了行动不便又急需增强免疫力的病人或老人的使用。应用现代工艺在完好保存有效成分的情况下，将燕窝加工成即食罐头，使携带方便，食用卫生、口感好，是燕窝应用的一大进步。

[1] 胡雅妮，李峰，康廷国.燕窝的研究进展[J].中国中药杂志，2003，28（11）：1003-1005.

[2] 陈念，刘鹏，王羚郦，等.燕窝生物活性及质量标准研究进展[J].生物技术通讯，2013，24（1）：143-146.

[3] 胡国昌，陈文锐，陈捷，等.燕窝及其制品的检测方法[J].食品科学，1996，17（11）：47-50.

[4] 查圣华，姜水红，王泽凤，等.燕窝中白燕和血燕对比研究[J].现代中药研究与实践，2011，25（2）：23-25.

[5] 姜水红，查圣华，谢丽芬，等.燕窝中唾液酸含量测定方法的研究[J].中国生化药物杂志，2009，30（5）：315-317.

[6] 华永有，杨艳，林美华.高效液相色谱法测定燕窝类保健品中唾液酸[J].中国卫生检验杂志，2010，20（10）：2454-2456.

Study on the Content Changes of Sialic Acid in Bird’s Nest before and after Process by HPLC

Zhuo Danru1，Que Huiqing2，Lin Sui2，Zhang Ning1，Qian Liping2，Lin Shancai1（1 Fuzhou Ruilaichuntang Biological Technology Co.，Ltd.，Fujian Fuzhou 350001，China；2 Fujian Academy of Medical Sciences）

Objective：To establish the separation and analysis methods of sialic acid in bird’s nest and investigate the content changes of sialic acid in raw material （dry bird’s nest after removal of impurities）and processed products of bird’s nest.Methods：Sialic acid （that is N-acetyl neuraminic acid）in bird’s nest was free from the combination of sialic acid glycoprotein through phosphoric acid hydrolysis.The content of sialic acid was determined by HPLC，and the evaluation was made on the fingerprints of three samples using the Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM，and the content changes of sialic acid were compared.Results：Sialic acid content of bird’s nest raw material was 9.898%and which was 9.921%and 9.913%after process by stew ing and making into canned bird’s nest，which was a little higher than the bird’s nest raw material.Conclusion：The content of sialic acid of processed bird’s nest was slightly higher than that of bird’s nest raw materials.It is indicated that sialic acid content can be better preserved in the ready-to-eat canned bird’s nest produced w ith modern technology.

Bird’s Nest Raw Material；Stewed Bird’s Nest；Ready-To-Eat Canned Bird’s Nest；Saliva Acid（N-Acetyl Neuram inic Acid）；HPLC；Sim ilarity Evaluation of TCM Chromatographic Fingerprint

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.06.004

2015-01-31）

卓丹如，女，中药师。主要从事中药生产与产品质量管理工作。E-mail：532056077@qq.com

阙慧卿，女，中药师。主要从事中药与天然药物成分的基础研究工作。通讯作者E-mail：284978108@qq.com