补肾利湿法对急性痛风性关节炎大鼠血清MMP-7影响的实验研究

姜德友 ，邹 丽，隋方宇，陈 飞，乔 羽，李富震，李文昊，韩洁茹

(黑龙江中医药大学，哈尔滨150040)

痛风是因嘌呤代谢紊乱及尿酸排泄障碍导致血尿酸升高，尿酸盐结晶沉着于关节及其他组织而引起病损及炎症反应的一种疾病［1-3］。痛风性关节炎则是由于血清及体液中尿酸升高，至尿酸盐结晶沉着于各种间叶组织中，当关节受累时而发病［4］。本研究采用尿酸钠联合氧嗪酸钾诱导大鼠急性痛风性关节炎模型，分别用痛风舒片、秋水仙碱片、补肾利湿法中药复方进行干预，测量急性痛风性关节炎大鼠血清MMP-7含量，探索补肾利湿法对急性痛风性关节炎防治机理。

1 实验材料

健康雄性SD大鼠84只，体质量(200±20)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(黑)2013004，饲养温度(20±2)℃，相对湿度:40%-45%，通风良好，环境适宜。补肾利湿法处方为姜德友教授经验方(熟地、山茱萸、怀牛膝等)［5］，由黑龙江中医药大学附属第一医院中药房一次性选购。痛风舒片(车前子、泽泻、防己、牛膝)购于湖北绿金子药业有限责任公司，批号:140301。秋水仙碱片购于西双版纳药业有限责任公司，批号140807。氧嗪酸钾盐购于美国 Sigma公司，批号:CAS2207-75-2。微晶尿酸钠结晶购于美国 Sigma公司，批号:CAS1198-77-2。大鼠血清UA、MMP-7 Elisa试剂盒购于北京诚森生物技术有限公司，产品批号:201501。电子天平(梅特勒公司，型号:AL204)、高速台式离心机(贝克曼公司，型号:X-22R)、恒温鼓风干燥箱(上海一恒，型号:DHG-9140A)、酶标仪(基因有限公司，型号:synergyH7)。

2 实验方法

2.1 溶液制备 尿酸钠悬浊液制备:将微晶尿酸钠结晶加入灭菌注射用水，配制成0.1 g/mL尿酸钠悬浊液。氧嗪酸钾溶液制备:将3 g的氧嗪酸钾晶体溶解于97 mL的灭菌注射用水中，加热搅拌，配制成3%氧嗪酸钾溶液［6］。秋水仙碱混悬液的制备:将秋水仙碱片研末，配置成0.028 mg/mL的秋水仙碱混悬液，4℃保存备用。痛风舒混悬液制备:将痛风舒片研末，配置成0.029 g/mL的痛风舒片混悬液，4℃保存备用。补肾利湿法中药复方溶液制备:补肾利湿法中药复方药液由黑龙江中医药大学附属第一医院提供，于60℃水浴中浓缩成含生药1、2、4 g/mL药液，高温消毒装瓶，4℃保存备用。

2.2 分组及给药方法 将84只SD大鼠，适应性喂养1周后随机分为7组:空白组、模型组、中药对照组、西药对照组、中药复方低、中、高剂量组，每组12只［7］。以每100 g大鼠体质量灌胃1 mL为标准。空白组、模型组分别灌胃生理盐水;中药对照组灌胃痛风舒混悬液;西药对照组灌胃秋水仙碱混悬液;中药复方低、中、高剂量组分别灌胃补肾利湿法中药复方溶液(含生药剂量依次为10、20、40 g/kg);每日1次，连续灌胃7 d，末次灌胃1 h后造模。

2.3 造模方法 空白组按3 mL/100 g体质量腹腔注射生理盐水，15 min后用BD针将0.2 mL生理盐水从大鼠右膝关节外侧以30°～40°向内斜插入并注入膝关节腔内。其余各组用3%氧嗪酸钾溶液按3 mL/100 g体质量腹腔注射，15 min后用BD针在大鼠右膝关节外侧以30°～40°向内斜插入至膝关节腔内，将0.2 mL尿酸钠溶液注入到膝关节腔内［8］。

2.4 标本采集及测量 血清指标采集及测定:各组造模4 h后眶下取血，随即处死。全血室温静置1 h后，4 000 r/min离心10 min，分离血清。按ELISA试剂盒说明书测定大鼠血清中UA及MMP-7含量。病理组织检测:取大鼠右膝关节滑膜组织，95%乙醇溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察滑膜组织病理变化。

2.5 统计学分析 运用SPSS 17.0软件分析，若数据属于正态分布、方差相齐则采用单因素方差分析、LSD-t检验;否则采用非参数检验，结果用均数±标准差(珋x±s)表示。

3 结果

3.1 病理组织观察 空白组滑膜细胞形态规则，排列整齐。模型组滑膜组织内见有尿酸盐结晶体，其周围见大量中性粒细胞浸润，滑膜组织明显水肿、炎性渗出;与空白组比较，模型组大鼠血尿酸水平明显升高(P＜0.01)，提示造模成功。中药对照组滑膜组织仍见水肿、坏死、大量中性粒细胞浸润，但渗出减轻。西药对照组滑膜组织仍见有轻度炎性渗出及水肿，但有血管增生。中药低剂量组滑膜组织仍有水肿与炎性渗出，大量中性粒细胞浸润。中药中剂量组滑膜组织有水肿，但无渗出及炎细胞浸润。中药高剂量组滑膜组织有炎细胞浸润，水肿减轻，渗出减轻(见图1)。

图1 各组大鼠关节滑膜组织病理学报告(HE染色，×400)

3.2 MMP-7含量测定 模型组与空白组比较大鼠血清MMP-7含量水平显著升高(P＜0.01);中药对照组，西药对照组，复方中药低、中、高剂量组大鼠血清MMP-7含量均较模型组显著降低(P＜0.01)，提示各组药物均可降低其含量;复方中药中剂量组与中药对照组、复方中药低、高剂量组相比差异有统计学意义(P＜0.01)，但与西药对照组相比差异无统计学意义(见表1)。

表1 不同治疗方法对各组大鼠血清中MMP-7水平影响(珋x±s，n=11)

4 讨论

急性痛风性关节炎是尿酸盐在关节及关节周围组织沉积后引起的急性炎症反应［9］。我国目前关于其致病指标主要以白介素、前列腺素等居多，虽然MMP-7作为一个常规的肿瘤研究指标［10］，但经实验证实，其与急性痛风性关节炎的发生也有紧密联系。MMP-7是一种基质溶解素，主要表达于上皮细胞中，在正常黏膜上皮细胞中为弱表达或不表达，在基质细胞中则不表达［11］，为基质金属蛋白酶(MMPs)成员之一。在生物学行为上，MMPs与炎症、基质降解、细胞生长、血管新生、肿瘤的转移和侵袭等都有密切关系［12］。此外，MMPs家族成员一般由5个功能不同的结构域组成［13］，其中的类血红蛋白结合区与酶的底物特异性有关。与其他的MMPs相比，由于MMP-7缺乏C-末端血红素样结构，不含类血红素结合区，因而具有更为广泛的底物特异性和基质降解功能。在正常软骨中，软骨细胞会把合成的大量II型胶原、蛋白多糖(PG)等物质分泌到细胞外基质(ECM)中，构成细胞外纤维网架，给细胞提供支持与保护［14］，而这些物质最终在基质金属蛋白酶(MMPs)的作用下降解。当病变时，病变滑膜分泌大量的蛋白酶(包括基质金属蛋白酶等)，而MMP-7是促进关节软骨基质降解的重要酶类，因其具有强大的底物降解功能，它的增多导致关节软骨MMPs/TIMPs平衡遭到破坏，最终导致疾病的发生。同时MMPs在痛风性关节炎的发病中介导了炎症细胞，参与炎症反应。并据研究发现，MMP-7主要由腺上皮细胞及巨噬细胞等分泌。而腺上皮细胞及巨噬细胞是参与炎症级联反应的主要部分之一。据报道，这些炎症细胞、细胞因子及炎性体在急性痛风性关节炎的发生与发展中起着重要作用。并且有研究表明，MMP-7可参与宿主自身的防御，促使迅速释放肿瘤坏死因子，从而启动了间质炎症反应［11］。本研究结果可以看到模型组大鼠血清MMP-7浓度明显高于空白组(P＜0.01)，提示MMP-7可能参与了痛风性关节炎急性期的发病过程，所以推测其作为一个炎性指标与痛风性关节炎的发生有着紧密联系。且大鼠血清中MMP-7的含量变化，与病理组织炎症反应程度呈正相关性。

中医学将痛风性关节炎归属于“历节病”“热痹”“白虎病”等范畴。临床表现为发病急骤、受累关节明显红肿热痛、昼轻夜重、疼痛剧烈难忍、足不能履地。本病病机为素体感受风湿热邪，郁而化热，或饮食不节，偏嗜高粱厚味［15］，导致湿热内盛，壅滞经络，流注关节，使关节红肿热痛。目前临床大多采用秋水仙碱或其他糖皮质激素类药物进行治疗，但此类药物的运用常伴有恶心、呕吐、腹泻等胃肠道等不良反应。姜德友教授根据自身多年临床经验，认为痛风性关节炎以肾虚为本，湿邪为标，乃本虚标实之证，因此确立了补肾利湿法治疗本病。补肾利湿法中药复方重用熟地黄以补血滋肾，益精填髓;山茱萸入肝肾二经，气温而主补，味酸而主敛，故精气益而腰膝强也。且山茱萸既可补阴又可补阳，为平补肝肾之品，与熟地合用，取肝肾同源之说;山药，脾肾同补，补肾固精，且补脾以助后天生化之源。清末张锡纯对此药更是推崇备至，在其医学专著《医学衷中参西录》中曾屡用山药。其言:“山药之性，能滋阴又能利湿，能滑润又能收涩。是以能补肺、补肾、兼补脾胃。”熟地黄、山茱萸、山药三药相伍，肝脾肾同补，起到“三阴并补”之效。泽泻，利湿泄浊，并防熟地之滋腻。在《药鉴》中曾记载:“泽泻……主分利小水之捷药也。又能除湿……仲景八味丸用之，亦不过接引诸药归于肾经耳。”茯苓淡渗以利湿，《本草疏证》谓其“能排脏腑、廓肌肤之诸水”。萆絯有祛风利湿之效。《药品化义》:“萆絯，性味淡薄，长于渗湿，带苦亦能降下，主治风寒湿痹。“牛膝取补肝肾，强筋骨，活血通经引血下行，利尿通淋之效，可使诸药引经下行于关节处。《医学衷中参西录》:“牛膝，原为补益之品，而善引气血下注，是以用药欲其下行者，恒以之为引经。故善治肾虚腰疼腿疼，或膝疼不能屈伸，或腿痿不能任地。”此几味药物合用，共奏补肾利湿，通络化瘀之功。血脉通，湿气除，则筋脉得以舒养，故对急性痛风性关节炎有很好的防治作用。

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