热者寒之细胞中药学初探

王 征，张 宁，王翠玲，刘竹兰，刘建利*

(1.西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，西北大学生命科学学院，西安710069;2.陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心，陕西中医药大学，陕西咸阳712083)

寒热温凉是中药的基本属性，寒凉和温热只是程度不同，所以通常简称为寒热。寒热证本质研究发现以热药造动物热证模型，可以用寒药治疗(逆转)，反之以寒药造寒证模型可以用热药治疗［1-2］。这是用动物实验方法验证中药热者寒之，寒者热之的治疗大法。通过观察中药对正常动物多项生理生化指标的影响，经数据对比分析，得到中药寒热药性与生理生化指标间的关系，建立中药寒热药性的评价模型［3-5］。以往的研究显示热药能够促进细胞生长，而寒药抑制生长［6-12］，这些结果构成了细胞中药学的首次探索。如果以热药造热证细胞模型(其主要表现为促进细胞生长)，然后用寒药逆转。这样就可以认为在细胞水平上实现热者寒之，将丰富细胞中药学的内容。相对于动物实验需要观察众多指标，细胞实验只观察细胞的生长及形态，相对简单了很多。

本研究分别以白胡椒、荜菝、高良姜、吴茱萸、肉桂造热证模型，然后用黄连、虎杖、白薇分别以5－800 μg/mL的浓度进行逆转。通过这样的实验来验证“热者寒之”的基本治则对于细胞来说是否同样适用。所选中药造模浓度分别是白胡椒50 μg/mL、荜菝 50 μg/mL、高良姜 100 μg/mL、吴茱萸 10 μg/mL、肉桂 20 μg/mL。

1 材料

1.1 细胞株 人胃癌细胞株SGC-7901，由第四军医大学提供。

1.2 实验仪器 μQuant酶标仪(美国Bio-Tek)、CO2培养箱(Sanyo公司)、细胞96孔培养板、普通倒置光学显微镜、超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.3 药品与试剂 黄连、虎杖、白薇、白胡椒、荜菝、高良姜、吴茱萸、肉桂(以上药物均购自西安藻露堂医药超市，经西北大学生命科学学院房敏峰高级工程师鉴定为正品药材)、HyClone改良型RPMI-1640培养液(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)、四季青无支原体胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、MTT、磷酸缓冲液、0.25%胰蛋白酶(西安舟鼎国生物技术有限公司)、无菌水、去离子水、DMSO。

2 方法

2.1 受试药品溶液的制备 称取黄连20 g，虎杖20 g，白薇 20 g，白胡椒 20 g，荜菝 20 g，高良姜 20 g，吴茱萸20 g，肉桂20 g，分别煎煮3次，每次30 min，合并水煎液，浓缩至20 mL，使各药质量浓度均为1 g/mL。药液10 000 r离心30 min，上清液用0.22 μm的微孔滤膜滤过，无菌水稀释至10 μg/μL，4℃冰箱保存备用。

2.2 细胞培养 将SGC-7901细胞消化于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(pH7.0 ～7.4)中，在恒温培养箱中37℃、5%CO2及饱和湿度条件下进行传代培养［13］。

2.3 MTT试验 取对数生长期SGC-7901细胞，调整细胞密度为5×107/L，接种于96孔板上。每孔200 μLRPMI-1640培养基，置于恒温培养箱中37℃、5%CO2及90%湿度条件下培养24 h。待细胞贴壁后，更换新鲜培养液(200 μL/孔)，造模各组分别加入不同体积的热药，造模浓度如上所述。同时设置对照组和调零孔，每个处理组设置3个平行孔。在培养箱中培养24 h后，吸弃含造模药物的培养基，用PBS洗清残留药物并加入新鲜培养基。再以相应的寒药进行逆转。逆转药物浓度梯度为5 ～800 μg/mL。加药完毕后96孔板置于恒温培养箱中培养24 h后，换新鲜培养液(180 μL/孔)。每孔加入新鲜配制的0.5%MTT溶液20 μL，继续在恒温培养箱中培养4 h。吸弃上清液，每孔加入 150 μLDMSO，震荡10 min(60次/min)后，用酶联免疫标定仪测定490 nm处吸光度(A)值。按下列公式计算细胞抑制率。抑制率为正值表示对细胞生长增殖有抑制作用，负值表示对细胞有促增殖作用［14-15］。实验重复3次。

细胞抑制率=(1－实验组A值/对照组A值)×100%

2.4 统计学处理数据以均数±标准差(珋x±s)表示，组间比较采用方差分析。

3 MTT实验结果

分别用白胡椒 50 μg/mL、荜菝 50 μg/mL、高良姜 100 μg/mL、吴茱萸 10 μg/mL、肉桂 20 μg/mL 进行造模，再以黄连、虎杖、白薇 3味寒药分 5～800 μg/mL8个浓度梯度分别进行逆转。所得结果分述如下:白胡椒组造模浓度为50 μg/mL，抑制率为－191.91%。即白胡椒在50 μg/mL时对癌细胞的生长促进作用极强。分别用黄连、虎杖、白薇对白胡 椒的促进作用进行逆转，所得实验数据如下表1。

表1 白胡椒造模数据表(白胡椒50 μg/mL、抑制率－191.91%)

由表1可以看出，黄连、虎杖、白薇3寒药的抑制率都为正值，即对癌细胞的生长都表现为抑制。这说明3寒药完全逆转了白胡椒的促进作用。达到了完全治疗的效果。3寒药的最佳逆转浓度分别是:黄连800 μg/mL、虎杖 800 μg/mL、白薇800 μg/mL。为了更加直观的看出3味寒药的逆转作用，以抑制率对浓度作图，得到下图1。

以同样的方法用荜菝 50 μg/mL、抑制率－29.82%，高良姜100 μg/mL、抑制率 －21.26%，肉桂20 μg/mL、抑制率 － 66.48%，吴茱萸 10 μg/mL、抑制率－22.82%，进行造模，用黄连、虎杖、白薇进行逆转。所得实验结果分别如下表2、表3、表4、表5所示，为了更加直观的看出黄连、虎杖、白薇对这4热药的逆转作用，以抑制率对浓度作图，得到了图2、图3、图4、图 5。

图1 白胡椒造模折线图

表2 荜菝造模数据表(荜菝50 μg/mL、抑制率－29.82%)

表3 高良姜造模数据表(高良姜100 μg/mL、抑制率－21.26%)

表4 肉桂造模数据表(肉桂20 μg/mL、抑制率－66.48%)

表5 吴茱萸造模数据表(吴茱萸10 μg/mL、抑制率－22.82%)

图2 白胡椒造模折线图

图4 白胡椒造模折线图

从以上表中可发现，黄连、虎杖、白薇作用于细胞后所得抑制率都为正值，即对细胞的生长表现为抑制。结合本实验，即3味寒药对荜菝、高良姜、肉桂、吴茱萸4热药所产生的促进作用都达到了逆转的效果。而且最大抑制浓度基本都是800 μg/mL。从图中可以直观的看到，抑制率随浓度增大而增大，具有比较好的浓度依赖关系。

图3 白胡椒造模折线图

图5 白胡椒造模折线图

从上述实验结果可以看出，所选寒药可以完全逆转热药对癌细胞生长的促进作用。即中医治则中“热者寒之”在细胞水平同样适用。

4 讨论

“寒者热之、热者寒之”是中医的基本治则。从以上结果可以看出，以热药造模寒药逆转效果良好。所用三种寒药对造模热药的促进作用逆转完全。以抑制率对浓度作图所得曲线基本也都是随着浓度的增加而上升，浓度依赖型效果良好。最佳治疗浓度基本都是800 μg/mL。原因是因为寒药对癌细胞生长的抑制作用是随浓度的增大而增大的。所以在最大浓度800 μg/mL理应是逆转效果最佳的浓度。这些结果表明，在细胞水平上中医治则“热者寒之”是适用的，并丰富了细胞中药学的内容。

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