一株苯并芘高效降解菌的筛选鉴定

2015-01-28弓玉红吕梁学院山西离石033000

安徽农业科学 2015年11期

弓玉红，李军，高平，王莉，赵君 (吕梁学院，山西离石033000)

苯并芘，分子式为 C20H12，分子量是 252［1］，极不易溶于水。这是它在环境中难于被降解的因素之一［2－4］。苯并芘是一种强致癌物，具有致癌、致畸、致突变性［5－7］。苯并芘存在于石油、食品、大气和煤焦油中，在土壤中也易残留［8－9］。许多国家都进行过土壤中苯并芘含量调查，残留浓度取决于污染源的性质与距离［10］。在焦化厂附近土壤中苯并芘含量为200 mg/kg，在被污染的土壤中高达650 mg/kg［11］。笔者在山西吕梁市离石区焦化厂周边耕地中采集被苯并芘污染的土壤和废水样品，分离、筛选到一株苯并芘降解能力较强的菌株A18。经鉴定，它属于木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)。该菌株首次被证实具有降解苯并芘的能力，具有从环境介质中清除苯并芘的较好效果，在苯并芘污染的微生物修复上具有很高的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料样品采自山西吕梁市离石区焦化厂周边耕地耕层土壤和废水。富集用培养基［12－14］1 L:(NH4)2SO40.5 g，NaNO30.5 g，CaCl20.02 g，KH2PO41.0 g，NaH2PO41.0 g，Mg-SO40.2 g，溶解苯并芘 5 mg 于丙酮后加水至 1 L，pH 7.5。2216E培养基1 L:蛋白胨5 g，酵母浸膏1 g，磷酸高铁0.01 g，pH 7.6 ～7.8。

1.2 苯并芘降解菌分离方法称取10 ml土样和水样的混合样，加入到90 ml无菌水中，加入适量玻璃珠，振荡3 h［15－17］。30 min 静置后，取5 ml上清液到 45 ml含有苯并芘浓度为1 mg/L的无机盐培养基中，28℃，150 r/min摇床避光培养。每隔7 d移取10 ml菌液至灭菌的90 ml无机盐－苯并芘液体培养基中富集培养，每转接一次苯并芘的浓度提高1 mg/L，如此4次后，苯并芘的最后浓度为5 mg/L。将最后一次的培养液稀释不同的梯度(10－1～10－7)，涂布于表面涂有苯并芘的选择性固体培养基平板上，28℃培养2 d。分别挑取单菌落，接种到2216E固体平板液体培养基中，反复划线，分离，经28℃培养箱倒置培养2 d，得到纯培养物，并且观察菌落形态，测量菌落大小，记录结果后斜面保存菌株。

1.3 降解菌的鉴定

1.3.1 分离菌株形态特征分析。菌株形态特征分析参照《常见细菌系统鉴定手册》、《真菌鉴定手册》［18］等进行。

1.3.2 16S rDNA的测序及系统发育树的构建。挑取适量菌株于含有100 μl ddH2O的1.5 ml离心管，研磨形成菌液，将77.5 μl菌液分别加入每管含有 10 μl buffer、12.5 μlDTT 的PCR管中，65℃水浴处理20 min，然后离心，置于冰上进行20 min处理，取上清为PCR反应的模板。把总DNA稀释至100 ng/μl，用稀释液为PCR扩增反应的模板，以蒸馏水为阴性对照，50 μl反应体系进行目的片段的扩增，然后对PCR扩增产物进行纯化，产物送上海桑尼生物工程公司测序。测序结果在NCBI中进行序列搜索比对后，选择亲缘关系较近的几种菌株作为参比菌株，用MEGA软件构建系统发育树［19］。

1.3.3 苯并芘含量的测定。采用萃取－紫外分光光度法，测定苯并芘含量［20］。用二氯甲烷试剂，配制梯度苯并芘标准溶液，用紫外分光光度计在300 nm波长处测定其梯度吸光度，作标准曲线。同时，在筛选得到的每种菌株的无机盐液体培养基中加入丙酮－苯并芘母液，使得苯并芘的终浓度达到5 mg/L。在转速150 r/min、温度28℃的条件下振荡培养12 d，同时设不接菌对照。用紫外分光光度计分别在300 nm波长处测定其吸光度，在标准曲线上计算出样品中剩余的苯并芘含量。

1.3.4 苯并芘降解率的计算。利用标准曲线计算样品中剩余苯并芘的含量，再利用公式c=(a－b)/a×100%计算降解率。式中，c为降解率;a为空白样品中苯并芘的含量;b为处理后剩余苯并芘的含量。

2 结果与分析

2.1 苯并芘降解率的测定以苯并芘为唯一碳源从焦化厂周边耕地耕层土壤和废水中筛选出一株降解菌，命名为A18。对A18进行苯并芘降解率测定。

由图1可知，试验得到苯并芘浓度在1.0～3.0 mg/L的范围内呈良好线形关系。对样品的吸光度值测定，样品的吸光度值为0.069，对照为0.135。用标准曲线的 y=0.427 4x－0.103 5计算得出对照的降解率(a)为0.557，样品的降解率(b)为0.307。利用公式c=(a－b)/a×100%计算降解率(c)，为44.8%。由此可知，菌株 A18在苯并芘浓度为5 mg/L，转速150 r/min，温度28℃的条件下，振荡培养12 d，苯并芘的降解率为44.8%。

2.2 苯并芘降解菌的筛选与鉴定菌株A18在PDA培养基上为气生菌丝，米黄色，较疏松，棉絮状。大型分生孢子纺锤形或镰刀形，基部有明显的脚胞，顶端细胞均匀地逐渐狭细，平直或稍弯曲。小型分生孢子较少，为长矩圆形或椭圆形，分生孢子梗为短梗形。厚垣孢子顶生或间生，成结节状或成串。根据上述形态特征，参考Booth镰刀菌分类系统，鉴定该菌株为木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)。

2.3 系统发育分析经PCR扩增获得的A18号菌的18S rRNA序列(NCBI序列号为 GQ505743.1)，与 GenBank中已报道的镰孢霉属(Fusarium LK.ex Fr.)真菌的18S rRNA序列有98%的同源性。系统发育分析结果显示，A18与弯镰孢霉组(赤霉属Gibbosum/Gibberella)真菌的一些已鉴定菌株(序列号为AY147368及AY147363)同属于一个簇群。根据A18的形态学特征、18S rRNA序列分析结果，参照镰孢霉属的分类学，将其鉴定为一种木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)。其系统发育关系见图2。