线粒体DNA分子技术在斑点叉尾鮰物种鉴定中的应用

罗志萍，肖武汉，黄迎波，周慧平，袁晓芬，王华全

(1.湖南出入境检验检疫局，湖南长沙410004;2.中科院水生生物研究所，湖北武汉430022;3.湖北出入境检验检疫局，湖北武汉430050)

斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)属名贵淡水经济鱼类，深受美国、加拿大及其他国家消费者的喜爱。加工好的成品或半成品在美国、日本、欧洲和加拿大等地市场均畅销，市场需求量极大。自1984年，我国湖北省水产研究所首次引进斑点叉尾鮰，随着繁育、养殖以及加工技术的日趋成熟，再加上高额的投资回报效益，使得斑点叉尾鮰的养殖业和加工业在我国迅速蓬勃发展，出口创汇效益也逐年攀升。目前斑点叉尾鮰的养殖已遍及我国大部分省市，其中在湖南、湖北、江西、安徽、江苏、四川和广东等地已大面积养殖。我国许多省区已将斑点叉尾鮰列为优势品种，是开发扶持以促进其产业化和出口创汇的主要对象，已经形成了产供销一条龙的产业链。

然而近年来，曾被美国政府视为“反倾销”而遭封杀的越南巴沙鱼借道中国贴着“中国斑点叉尾鮰”的标签进入美国市场，严重损害我国斑点叉尾鮰的品牌，影响了我国斑点叉尾鮰产品的正常出口，扰乱了国际斑点叉尾鮰市场。由此导致美国FDA对中国出口的斑点叉尾鮰产品采取随机检查行动，以中国出口的成品或半成品中斑点叉尾鮰物种不符为由的退货和通报事件，而且还有愈演愈烈之势。由于目前尚无半成品斑点叉尾鮰中物种鉴定方法，面对国外技术贸易壁垒，我国斑点叉尾鮰出口贸易只能陷入被动局面。

对于已加工好的斑点叉尾鮰成品和半成品，由于形态已发生完全改变，主要依据骨骼结构和外部形态特征的传统物种鉴定方法在斑点叉尾鮰的物种鉴定上已完全不适用。此外，在成品和半成品中，由于细胞结构的破坏和蛋白质的变性，依据染色体特征的细胞分类学方法以及依据同功酶数据的酶学鉴定方法等也同样不适合斑点叉尾鮰的物种鉴定。由于DNA的相对稳定性和DNA序列数据的超敏感性，特别是线粒体DNA的高拷贝数，尝试利用DNA分子数据，特别是线粒体DNA的序列数据，建立一种能被国际上普遍接受的物种鉴定方法和标准，才是切实可行的。

有关科技查新结果表明，国外已有线粒体DNA的PCRRFLP的数据进行鳕鱼、比目鱼等制品中物种鉴定的报道［1－14］，但均没有线粒体DNA的D-loop区的分子数据来进行斑点叉尾鮰物种鉴定方面的报道。而PCR-RFLP方法操作过程繁琐，多用于对同一物种的不同群体进行遗传多态性分析，不适于快速、经济的鉴定斑点叉尾鮰物种。线粒体DNA控制区具有个体和种群特异性，已被国际上广泛地用来作为物种鉴定的标准，尤其是D-loop控制区，不同物种差异较大，可以准确鉴定物种。

1 材料与方法

1.1 样本采集 考虑到在实际国际贸易中被冒用的可能性，选用斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus、大口鲇Silurus meridionalis、革胡子鲶Clarias leather、鲤Cyprinus carpio和鲫 Carassius auratus，样本取自长江水产研究所，取其肌肉组织用95%乙醇固定，保存于－20℃。

1.2 方法

1.2.1 引物设计。D-loop引物是根据NCBI数据库斑点叉尾鮰已知序列自行设计。引物序列为:D-loopF:GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC;D-loopR:GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG。

COⅠ根据参考文献采用通用引物，序列为:LCO-1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG;HCO-2198:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAT。

1.2.2 基因组DNA的提取和检测。基因组DNA的提取采用常规的酚－氯仿抽提法，参考萨姆布鲁克(2002)的方法和其他学者的研究方法［15－16］稍作改动。取用乙醇固定的尾鳍约0.1 g于2 ml离心管中，剪碎，置于37℃烘干。向离心管中加入500 μl抽提缓冲液，并加入RNaseA，至终浓度为20 μg/ml，37℃水浴1 h。然后向抽提缓冲液中加入蛋白酶K至终浓度为200 μg/ml，55℃水浴过夜。将消化好的样品冷却至室温后，加入等体积的酚-氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻轻地上下颠倒10 min，使充分混匀，12 000 r/min离心10 min。用扩口枪头小心地吸取上层水相至另一新的离心管中。吸取上清液，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，操作同上，重复抽提1次。吸上清，加入1/10体积的NaAc，轻摇混匀，加2倍体积－20℃预冷的无水乙醇，待有絮状沉淀析出后，置于－20℃沉淀1～2 h。12 000 r/min离心10 min。弃上清，用4℃ 70%乙醇洗涤2次，4℃、10 000 r/min离心5 min，弃上清，让沉淀自然风干，待白色沉淀变为无色透明时加入300 μl TE贮存液溶解DNA，保存于－20℃备用。用蛋白质–核酸检测仪测定DNA的浓度和A260/A280。用0.8%的琼脂糖凝胶(含10 mg/ml EB)对DNA样品进行电泳，在凝胶成像系统中观察、拍照，从电泳图判断提取DNA的质量。

1.2.3 基因扩增与检测。PCR扩增的基本反应体系25.0 μl，包括10 × Taq DNA 聚合酶 2.5 μl，MgCl2(25 mmmol/L)2.0 μl;dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μl;引物(10 pmol/μl)各0.5 μl，DNA 模板(100 ng/μl)0.5 μl，Taq DNA 聚合酶(1 U/μl)1.0 μl，超纯水 18.0 μl。

采用以上PCR反应体系对斑点叉尾鮰、革胡子鲶、大口鲇、鲤等进行PCR扩增。扩增反应的基本热循环参数:95℃预变性5 min;94℃变性30 s，54.8℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环;最后72℃延伸10 min，然后降温至12℃。

为扩增出特异性的目的条带，在其他反应参数不变的条件下，调节退火温度，最终得到条带清晰的目的产物。

1.2.4 序列测定。对得到的斑点叉尾鮰D-loop和COⅠ片段进行胶回收，测序。

1.2.5 酶切鉴定。对测序得到的D-loop序列，用软件DNA club查找酶切位点。经查找，在D-loop序列的200 bp处有一特异的酶切位点EcoRⅠ。利用此限制性内切酶分别对斑点叉尾鮰和革胡子鲶的D-loop序列进行酶切鉴定，37℃酶切3 h，电泳检测。

酶切体系:10 × buffer 1 μl，EcoRⅠ0.5 μl;D-loop 8.5 μl。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取结果 采用常规的酚－氯仿法提取用乙醇固定的斑点叉尾鮰组织DNA，分子量约10 kb。取2～4 μl DNA样品，在0.8%琼脂糖上检测，条带纯度和亮度都较高，几乎无拖尾现象。用核酸蛋白仪进一步检测显示，DNA 浓度在400 ～1 500 ng/μl，A260/A280在1.65 ～1.82。因此该方法所提基因组DNA完全可以满足线粒体D-loop扩增的要求。

2.2 PCR扩增结果 为扩增出特异性的目的条带，在其他反应参数不变的条件下，调节退火温度，最终得到条带清晰的目的产物。其中，D-loop对应的最佳退火温度为54.8℃，PCR扩增结果见图1、2。

由图1可知，只有斑点叉尾鮰和革胡子鲶可以利用所设计的特异性引物扩增出清晰的D-loop序列，说明两者的亲缘关系较近，可以作为斑点叉尾鮰区分于其他亲缘关系较远物种的方法。

由图2可知，采用通用引物，在以上几个物种中均可以扩增得到分子量大小相差不大的COⅠ片段，所以，仅用PCR扩增COⅠ序列不能区分斑点叉尾鮰和其他物种，需进一步测序鉴定。

2.3 测序及比对结果 测序得到斑点叉尾鮰的D-loop序列，经过Blast，D-loop序列与NCBI数据库已有的序列一致性达到98%(图3)。

斑点叉尾鮰与革胡子鲶D-loop比对结果见图4。经过Blast，一致性为88%。

2.4 酶切鉴定结果 D-loop序列经EcoRⅠ酶切和电泳检测，结果见图5。由图5可知，斑点叉尾鮰的D-loop序列被酶切成2个片段，大的分子量为900 bp左右，小的分子量为200 bp左右，而革胡子鲶的D-loop序列没有被切开。由此可知，不需测序能够简单地鉴定出斑点叉尾鮰物种。

3 讨论

该研究采用自行设计的引物对斑点叉尾鮰及其他几个物种的D-loop和COⅠ区进行PCR扩增并测序，经比对发现不同物种之间的序列差异较大。建立的从斑点叉尾鮰肌肉组织中提取DNA的简易方法能够进行PCR扩增和序列分析，所测定的DNA序列正确无误。这说明依据最小片断的长度和序列设计的特异性PCR引物，在常规条件下很易扩增所需的线粒体DNA片段，所设计的PCR引物具有物种特异性。因此在大批量的产品检验中可以使用该引物进行扩增筛选，再根据D-loop和COⅠ序列的比对直接鉴定出斑点叉尾鮰。

为了进一步区分其近似物种，该研究测定斑点叉尾鮰近似物种和不同种群线粒体DNA的D-loop的序列，确定斑点叉尾鮰物种特异性的最短DNA序列片断，在此基础上寻找其酶切位点，并进行酶切鉴定。结果表明该方法建立的特异性酶切图谱可以区分近似物种，在经过相对少的酶切和电泳后，不需测序能够将斑点叉尾鮰与其他近似物种区分开来。

该研究采用线粒体DNA分子鉴定技术，在参阅国外斑点叉尾鮰线粒体DNA序列数据的基础上，通过进一步探索和优化，建立了斑点叉尾鮰物种的快速分子鉴定方法并研制出检测试剂盒，目前该技术已应用于水产品进出口贸易过程中物种真伪检验鉴定的技术执法工作。该研究成果为优化和提高检验检疫执法运行效能提供了技术保障，为我国打破国外技术贸易壁垒、制定标准法规提供了技术支撑，同时也有助于我国水产品行业商业欺诈认定裁决工作。

［1］肖武汉，张亚平.鱼类线粒体DNA的遗传和进化［J］.水生生物学报，2000，24(4):384 －391.

［2］肖武汉，张亚平.银鮰自然群体线粒体DNA的遗传多样性［J］.水生生物学报，2000，24(1):1 －10.

［3］XIAO W H，ZHANG Y P，LIU H Z.Molecular systematics of Xenocyprinae(Teleostei:Cyprinidae):Taxonomy，biogeography and coevolution of a special group restricted in East-Asia［J］.Molecular Phylogenetics and Evolution，2001，18(2):163 －173.

［4］LUO J，ZHANG Y P，ZHU C L，et al.Mitochondrial DNA diversity in Crucian carp［J］.Acta Genetica Sinica，1999，26(1):28 －36.

［5］LUO J，ZHANG Y P，ZHU C，et al.Genetic diversity in crucian carp(Carassius auratus auratus)［J］.Biochem Genet，1999，37(9/10):267 －79.

［6］WALDBIESERG C，LELANIA B A，NONNEMAN D J.Complete sequence and characterization of the channel catfish mitochondrial genome［J］.DNA Seq，2005，14(4):265 －277.

［7］PEPE T，TROTTA M，CENNAMO P，et al.Mitochondrial cytochrome b DNA sequence variations:an approach to fish species identification in processed fish products［J］.Food Prot，2005，68(2):421 －425.

［8］GOMES C，OXENFORD H A，DALES R B G.Mitochondrial DNA D-loop variation and implications for stock structure of the four-wing flyingfish，Hirundichthys affinis，in the central western Atlantic［J］.RBG Bulletin of Marine Science，1999，64(3):485 －500.

［9］HWANG D F，JEN H C，HSIEH Y W，et al.Applying DNA techniques to the identification of the species of dressed toasted eel products［J］.Agric Food Chem，2004，22;52(19):5972 －5977.

［10］MURGIA R.Genetic identification of grey mullet species(Mugilidae)by analysis of mitochondrial DNA sequence:application to identify the origin of processed ovary products(bottarga)［J］.Mar Biotechnol(NY)，2002，4(2):119－126.

［11］JEROME M.Direct sequencing method for species identification of canned sardine and sardine-type products［J］.Agric Food Chem，2003，51(25):7326－7332.

［12］HWANG D F.Identification of tetrodotoxin and fish species in a dried dressed fish fillet implicated in food poisoning［J］.Food Prot，2002，65(2):389－392.

［13］SOTELO C G.Identification of flatfish(Pleuronectiforme)species using DNA-based techniques［J］.Agric Food Chem，2001，49(10):4562 －4569.

［14］SEBASTIO P.Identification of anchovy(Engraulis encrasicholus L.)and gilt sardine(Sardinella aurita)by polymerase chain reaction，sequence of their mitochondrial cytochrome b gene，and restriction analysis of Polymerase Chain Reaction Products in Semipreserves［J］.Agric Food Chem，2001，49(3):1194 －1199.

［15］肖武汉，张亚平.一种从鱼类卵巢制备地高辛标记mtDNA探针的简易方法［J］.动物学研究，1997，18(1):58.

［16］肖武汉，张亚平.福尔马林固定云南鮰DNA提取及其细胞色素b基因序列分析［J］.动物学研究，1997，18(3):24 －27.