激素对蝉拟青霉胞内核苷合成的影响

陈安徽，邵 颖，李继武，韩富海

(1.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，徐州工程学院，江苏徐州221008;2.安徽省亳州千草药业有限公司，安徽亳州236800)

蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)隶属麦角菌科(Clavicepitaceae)虫草属(Cordyceps)，又名雌蝉花、蝉棒束孢(Isaria cicadae)，是我国传统中药材蝉花(Corcyceps sobolifera)的分生孢子即无性型阶段［1－4］。研究表明，蝉拟青霉的人工发酵培养物中含有多种与天然野生蝉花相同的活性成分，有些活性成分的含量甚至高于野生蝉花及同属的冬虫夏草。李瑞雪等［5］采用反相高效液相色谱法对蝉拟青霉RCEF1081人工发酵菌丝体中的活性成分进行分析，发现其中虫草素和鸟苷含量是冬虫夏草的2.8倍。葛飞等［6］通过检测发现蝉拟青霉RCEF0943菌株液体发酵菌丝体中的腺苷含量显著高于野生蝉花。核苷类物质特别是腺苷是虫草属真菌的主要功能性活性成分，具有调节中枢神经系统中的不同生理过程、抑制中枢神经元的兴奋性、增加冠状动脉血流量、降血压、减慢心率及抗肿瘤等重要的生理作用［7－10］。现代研究表明激素对微生物的生长发育会产生特定的影响［11－12］。

笔者以6-苄氨基嘌呤(6-BA)和3-吲哚乙酸为考察对象，探索2种激素对蝉拟青霉液体发酵过程中菌丝体生长及胞内总核苷、胞内腺苷合成的影响，为人工虫草资源的开发与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌种与试剂。菌种:蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)菌种保存于食品工程学院发酵工程实验室。试剂:3-吲哚乙酸、6-苄氨基嘌呤、腺苷、尿苷、胞苷、鸟苷标准品，美国Sigma公司;95%乙醇等均为国产分析纯。

1.1.2 培养基。固体斜面培养基:葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%、琼脂2%;种子培养基:葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%;液体培养基:葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母膏1%。

1.1.3 仪器与设备。梅特勒电子天平，AE200型，上海分析仪器厂;手提式压力蒸汽灭菌器，YXQ.SG4﹨.280，上海华线医用核子仪器有限公司;Freeze Dry Systems(冷冻干燥系统)，040520111G，美国LABCONCO公司;SENCO R-502B旋转蒸发器，上海申胜生物技术公司;高效液相色谱仪LC3100，安徽皖仪科技股份有限公司;高效液相色谱紫外检测器UV3100，安徽皖仪科技股份有限公司;分析柱Synergi Hydro(4.6 mm ×250 mm，4 μm)，美国 Waters公司;超净工作台，AIR TECH，苏净集团安泰公司;光照培养箱，LRH-250-G，广东省医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1 菌种的发酵方法。6-BA、3-吲哚乙酸按照5 mg/L的添加比例添加到装有200 ml液体培养基的500 ml三角瓶中，另配制不添加激素的培养基。于3种培养基中分别按照10%的接种量接种蝉拟青霉液体种子，25℃、120 r/min条件下恒温振荡培养并定期测定生物量及胞内核苷含量，每个试验均重复3次。

1.2.2 生物量的测定及菌丝体的获得。菌种培养过程中，每隔24 h取样，获得的发酵醪液抽滤后用蒸馏水反复冲洗菌丝体5次，菌丝体冷冻干燥后准确称重。按照下式计算生物量，干燥菌丝体粉碎过100目筛，备胞内核苷含量的检测。

生物量(g/L)=菌丝体干重(g)/发酵醪液体积(L)

1.2.3 胞内总核苷含量的检测。准确称取腺苷、尿苷、鸟苷、胞苷标准品各0.1 g定容至100 ml，得到4种标准样品质量浓度均为1 mg/ml的混合标准品溶液。再将标准混合溶液稀释并配制成0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/ml的溶液，采用分光光度计法测定溶液吸光值，并绘制标准曲线。

称取干菌丝体0.1 g于试管中，加入20 ml 75%乙醇超声萃取1 h后于4 000 r/min下离心15 min，上清液转入25 ml容量瓶并定容。将溶液再稀释为0.04 mg/ml后以75%的乙醇作为空白对照测定溶液吸光值。

1.2.4 胞内腺苷含量的检测。腺苷标准曲线的绘制:准确称取腺苷标准品0.01 g置于10 ml容量瓶中，用65%的乙醇定容至刻度;将标准液稀释成 0.025、0.050、0.100、0.150、0.200 mg/ml的溶液进行HPLC分析并绘制腺苷标准曲线。

样品检测:称取干菌丝体0.1 g于试管中，加入20 ml 75%乙醇超声萃取1 h后于4 000 r/min下离心15 min，上清液转入25 ml容量瓶并定容。溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤后得样品液，样品液经适当稀释进行HPLC分析。

高效液相色谱条件:0.01 mol/L磷酸二氢铵溶液为A液，甲醇为B液，洗脱梯度设置为:100%A液5 min、80%A液+20%B液5 min、60%A液+40%B 液20 min、100%B 液10 min、100%A 液10 min;流速 1.0 ml/min，柱温 25 ℃，UV 检测波长:260 nm;进样量:20 μl。

1.3 数据处理与分析 采用DPS(V3.01)专业版数据统计分析软件进行数据统计分析。数据统计结果均以平均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 蝉拟青霉的生物量 由图1可知，在该试验条件下，6-BA和3-吲哚乙酸均有促进蝉拟青霉菌丝体合成的作用。其中6-BA试验组的最大生物量为6.135 g/L，3-吲哚乙酸组的最大生物量为5.860 g/L，空白对照组最大生物量为5.151 g/L，2实验组与空白对照组相比最大生物量分别提高了19.10%和13.76%，方差分析表明，差异达到显著水平(P＜0.05)。

由图1还可知，6-BA和3-吲哚乙酸试验组蝉拟青霉的最大生物量比对照组提前1 d到达，很大程度上缩短了蝉拟青霉的发酵周期。

2.2 胞内总核苷含量的变化 以各质量浓度的标准品吸光值为纵坐标，总核苷标准品浓度为横坐标，得到线性回归方程为 Y=39.35X+0.027 1，R2=0.992 2，线性范围为0.002 ～0.010 mg/ml，胞内总核苷含量标准曲线见图2。

由表1可知，试验组和对照组均在发酵第3天时胞内总核苷含量达到最大值。在发酵前期，2种激素并未对核苷含量产生影响，但在发酵第3天激素刺激蝉拟青霉胞内核苷急剧累积，6-BA和3-吲哚乙酸试验组胞内总核苷含量分别达到最大值18.49 mg/g和16.77 mg/g，比对照组的最高含量11.19 mg/g分别提高了65.24%和49.87%。统计分析发现，2个试验组胞内核苷的最高含量均显著高于对照组(P＜0.05)。另外，6-BA试验组在第3天总核苷量达到最高，但随着发酵的进行总核苷含量迅速降低，而3-吲哚乙酸试验组在发酵第3天胞内核苷含量达到最高后并未随着发酵过程的推移出现急剧下降的趋势。

2.3 胞内腺苷含量的变化 以不同质量浓度的腺苷标准溶液的HPLC峰面积进行回归分析，得到腺苷含量的回归方程为 Y=14.931X －82.34，R2=0.998 6，线性范围为 0.025 ～0.200 mg/ml。在质量浓度范围内，质量浓度与峰面积呈现良好线性关系。对各组样品进行胞内腺苷含量的检测，结果见表2。

由表2可知，6-BA和3-吲哚乙酸均对蝉拟青霉液体发酵过程中胞内腺苷的合成产生一定的影响。3-吲哚乙酸试验组胞内腺苷含量较6-BA组和对照组提前24h达到最大值。6-BA显著提高了胞内腺苷的含量，最高含量达到2.32 mg/g，比对照组和3-吲哚乙酸试验组胞内腺苷的最高含量分别提高了32.57%和27.47%。6-BA更有利于蝉拟青霉胞内腺苷的合成。

表1 激素对蝉拟青霉发酵总核苷的影响 mg/g

表2 激素对蝉拟青霉发酵产腺苷的影响 mg/g

3 讨论

随着天然虫草资源的枯竭，虫草已远无法满足市场需求。虫草无性型菌株液体发酵菌丝体作为天然虫草资源的代用品越来越得到人们的追捧。虫草菌株的液体发酵及活性物质的研究开发逐渐成为研究热点。大量研究表明植物激素和动物激素均可调控微生物的生长发育过程，激素作为有效的基因开关可以促进细胞中靶基因的表达及物质的合成。该研究在蝉拟青霉液体深层发酵过程中添加6-BA和3-吲哚乙酸2种激素以考察激素对蝉拟青霉代谢途径的影响。该试验条件下，向蝉拟青霉液体培养基中按照5 mg/L的比例添加6-BA和3-吲哚乙酸，发现2种激素对蝉拟青霉生物量、胞内总核苷和胞内腺苷的含量均产生了一定的影响。6-BA与3-吲哚乙酸组生物量较对照组提前1 d达到最大值，大大缩短了蝉拟青霉的发酵周期，同时2种激素也促进了胞内总核苷和腺苷的合成。腺苷是虫草属真菌的主要活性成分之一，目前已作为检测虫草类制品质量的重要质控指标，2种激素在蝉拟青霉液体深层发酵过程中的添加对于提高虫草相关制品品质发挥了积极作用，同时也说明激素确实会改变微生物的代谢途径及生长节奏。至于激素对蝉拟青霉液体发酵过程中代谢产生其他活性成分的影响程度及激素不同添加量对活性物质累积的影响有待于进一步研究。

激素在蝉拟青霉液体发酵过程中的添加可以缩短发酵周期，提高胞内总核苷和腺苷的含量。该研究的开展将为蝉花有效代用品的开发提供途径，为虫草资源的有效应用提供参考。

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