笼养条件下花尾榛鸡的遗传多样性分析

田万年，钟 宝 (长白山动植物资源利用与保护吉林省高校重点实验室，吉林吉林132101)

花尾榛鸡(Bonasa bonasia)是鸡形目雉科鸟类，俗称飞龙，是东北地区典型的森林留鸟［1］。其在东北曾有大规模的分布，长期以来，因狩猎致使数量下降而成为国家Ⅱ级保护鸟类。目前国内对其饲养繁育及疾病等方面进行了较为深入的研究，但有关花尾榛鸡的分子生态学方面研究尚未见报道。线粒体DNA(mtDNA)具有母性遗传、进化速率快、拷贝数多的特点，是目前生物体研究中应用最广泛的遗传标记之一。细胞色素b(Cyt b)是mtDNA编码的呼吸链上重要的酶之一，作为一种高效的母系遗传标记，已被广泛应用于系统发育研究［2］。笔者以分子生态学研究中使用最为普遍的mtDNA的控制区和细胞色素b(Cyt b)作为分子标记，对花尾榛鸡的遗传多样性进行分析，以期为制定科学的繁育计划、对花尾榛鸡进行遗传保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集 吉林花尾榛鸡来自吉林市左家珍禽养殖场，采集不同个体花尾榛鸡抗凝血15份，置于冰瓶带回实验室，－20℃保存备用。用全血基因组提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2 Cyt b基因的扩增和序列测定 根据GeneBank中已发表的松鸡基因序列(AB120132)，利用Primer Premier 5.0软件设计一对引物。上游引物P1:5＇-ATG GCA CCC AAC ATC CGA AAA T-3＇，下游引物 P2:5＇-TTA GTG GTT GAG TAT TTT GTT T-3＇，预期扩增大小为1 143 bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性45 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环;72℃延伸5 min。PCR产物的纯化、回收和测序由上海英俊生物技术有限公司完成。

1.3 统计分析 应用Clustal W(1.82)软件进行多序列比对，通过MEGA4.0软件计算不同序列间的核苷酸代替、变异位点、转换颠换比率及遗传距离等。用DNAsp4.10软件计算单倍型、单倍型多样性、核苷酸多样性。利用MEGA软件计算品种间距离，利用UPGMA法构建品种的分子系统树。

2 结果与分析

2.1 花尾榛鸡Cyt b基因PCR扩增结果 通过DNA分子质量标准和测序结果得知，Cyt b基因PCR产物大小为1 143 bp，与预期结果一致。

2.2 花尾榛鸡Cyt b基因的核苷酸多态位点的突变类型 通过对15条花尾榛鸡Cyt b基因序列(15条序列由该试验测定，其余11条序列来源于GenBank)分析结果表明，所有序列全长均为1 143 bp，无插入和缺失，共发现12个变异位点，包括9个转换和3个颠换。核苷酸的替换位点主要以转换为主，表现出较高的转换偏倚。12个变异位点定义了6种单倍型。

2.3 花尾榛鸡Cyt b基因系统进化分析 利用Clustal W(1.82)软件对花尾榛鸡mtDNA Cyt b序列进行同源序列对比，结果发现，15只花尾榛鸡Cyt b基因全序列由6种单倍型组成。结合所有的群体单倍型序列，并引用GenBank中的部分松鸡科Cyt b基因序列，采用UPGMA法，以Kimura双参数模型构建系统发育树。从图2可以看出，基于Cyt b基因吉林花尾榛鸡与榛鸡属Tetrastes bonasia(NC-020591)亲缘关系最近，与斑尾榛鸡(AF230166)处于一个分支，而北美榛鸡属(AF230167)单独处于一个分支。黑琴鸡(AF230166)、松鸡(AF230179)和岩雷鸟(AY156346)共在一个分支上。

3 讨论

花尾榛鸡的肉质口感细嫩，肉味极其鲜美且具有良好的滋补作用和扶正固本的药效，具有非常高的经济价值［3］。近年来由于对花尾榛鸡栖息地环境破坏及大量捕猎，花尾榛鸡的野生数量急剧减少。目前，我国关于花尾榛鸡的研究主要集中在人工驯养和养殖、疾病防治、饲料及营养、人工孵化及育雏等方面［4－8］。研究手段较单一，研究深度不够，繁殖率低、幼雏成活率低等问题尚未能解决。因此，对花尾榛鸡的遗传、生理及进化等方面进行系统的研究为花尾榛鸡的保护及生产利用提供有效的保证。目前，对于花尾榛鸡种群遗传多样性分析研究较少。杨秀芹等［9］对花尾榛鸡MC4R基因进行了克隆和序列分析。蔡晓淇［3］对花尾榛鸡的系统地位与BLB基因多态性进行了研究。该试验测定和分析了吉林地区花尾榛鸡15只样本的mtDNA Cyt b基因序列，共检测到12个多态位点，定义了6种单倍型。

目前我国对松鸡科鸟类的种属分类存在争议，最早认为划分为9属。国内学者通过形态、分子系统学等方法认为应将划分为7属或6属。对于花尾榛鸡的分类地位主要集中北美榛鸡属Bonasia和榛鸡属Tetrastes。该试验通过测定花尾榛鸡mtDNA Cyt b基因序列，构建系统发育树结果表明，笼养吉林花尾榛鸡与榛鸡属Tetrastes bonasia(NC－020591)亲缘关系最近，与斑尾榛鸡(AF230166)处于一个分支，而北美榛鸡属(AF230167)单独处于一个分支。该研究支持花尾榛鸡属于松鸡科榛鸡属，不应并入北美榛鸡属，与包新康等［4］、蔡晓淇等［10］的观点一致。

［1］朱井丽.长白山东部山区越冬期花尾榛鸡种群密度及分布［J］.黑龙江生态工程职业学院学报，2011，24(3):24－25.

［2］刘向华，王义权，刘忠权，等.从Cytb基因序列探讨鹿亚科动物的系统发生关系［J］.动物学研究，2003，24(1):27 －33.

［3］蔡晓淇.花尾榛鸡的系统地位与BLB基因多态性研究［D］.哈尔滨:东北林业大学，2013.

［4］包新康，刘发，顾海军，等.鸡形目鸟类系统发生研究现状［J］.动物分类学报，2008，33(4):720 －732.

［5］赵匠，易国栋，郝锡联，等.珍禽花尾榛鸡的研究现状及展望［J］.吉林师范大学学报，2006(2):60－61.

［6］李爱国，李国君.花尾榛鸡野生驯养方法［J］.特种经济动植物，2009(10):8－9.

［7］杜继红，周玉秋.花尾榛鸡的养殖［J］.中国禽业导刊，2006，23(18):31－32.

［8］孙淑霞，薛茗元，张克勤.花尾榛鸡人工饲养技术［J］.中国家禽，2014，36(6):55－58.

［9］杨秀芹，张冬杰，刘娣.环颈雉和花尾榛鸡MC4R基因的克隆和序列分析［J］.中国畜牧杂志，2010，46(17):16 －18.

［10］蔡晓淇，白素英，金煜.松鸡科13种鸟类COⅠ序列变异及系统发育分析［J］.动物分类学报，2012，37(2):269－273.