白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的提取工艺研究

程 敏，田童童，李 甜，朱新荣，张 建

（石河子大学食品学院，新疆石河子832003）

白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的提取工艺研究

程 敏，田童童，李 甜，朱新荣，张 建*

（石河子大学食品学院，新疆石河子832003）

以白芸豆为原料，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测白芸豆中α-淀粉酶抑制剂（α-AI）抑制率。在单因素的基础上，选择料液比、pH值、提取时间、提取温度为自变量，α-AI抑制率为响应值，利用响应面分析法，研究各自变量及其交互作用对α-AI抑制率的影响。根据预测模型得到最佳的提取工艺条件为料液比1∶30.05（g∶mL），pH值为3.6，提取时间2.66 h，提取温度50.14℃。在此条件下得到的α-AI抑制率为95.435%。所得白芸豆α-AI抑制率提取回归模型高度显著（R2=0.973），拟合性好，可用于预测白芸豆中α-AI抑制率。

白芸豆；提取；α-淀粉酶抑制率；响应面分析

白芸豆（white kidney bean）属豆科（Leguminosae），蝶形花亚科（Papilionoideae），菜豆族菜豆属[1]，原产美洲的阿根廷和墨西哥，后经人工栽培驯化已适应冷凉潮湿的高原地带。白芸豆营养价值丰富，据分析，每100 g干豆中含碳水化合物37.6%～48.5%，蛋白质19.9%～20.0%，脂肪1.6%～2.1%，钙120 mg，铁10 mg[2]。白芸豆作为一种高钾低钠食品，适合于高血脂、心脏病、动脉硬化和忌盐患者食用。因为价格便宜，所以在国内外倍受消费者的青睐。

白芸豆富含α-淀粉酶抑制剂和膳食纤维。α-淀粉酶（l,4-α-D-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.l）作用于淀粉时，从其分子内部切开α-1,4糖苷键，生成还原糖和糊精，由于产物的末端残基碳原子为α构型，故称为α-淀粉酶。能与α-淀粉酶分子上的相应部位结合并引起α-淀粉酶分子构象改变，使其催化活性降低或者丧失的化合物为α-淀粉酶抑制剂（α-amylase inhibitor，α-AI），属于糖普水解酶抑制剂的一种，国外称之为“淀粉阻断剂（starch blocker）”。它能有效阻断高淀粉类食物（杂粮、面食、米饭及相关糕点和零食）中淀粉的分解，阻断大部分淀粉热量的摄取，减少人体最大的脂肪来源。而且白芸豆α-淀粉酶抑制剂经胃肠道排出体外，不必经过血液循环，不作用于大脑神经中枢，食用后不腹泻、不乏力、不厌食、体质量不反弹、完全符合世界卫生组织的减肥原则[3-6]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白芸豆：购买于新疆石河子市农贸市场；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：上海盐季生物有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市巴斯夫化工有限公司；盐酸（分析纯）：北京化工厂；可溶性淀粉（分析纯）：天津市化学试剂三厂；葡萄糖（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；丙三醇（分析纯）：天津永晟精细化工有限公司；α-淀粉酶（分析纯）：北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

UVmini-1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；Multifuge X3高速冷冻离心机：美国Thermo Heraeus公司；RHP-600高速多功能粉碎机：浙江荣浩工贸有限公司；EPED-20TJ超纯水器：南京易普易达科技发展有限公司；ZXRD-7080全自动新型鼓风干燥箱：上海智城分析仪器制造有限公司；85-1磁力搅拌器、DK-8D数显恒温水浴锅：江苏金坛市医疗仪器厂；JM-B10002电子天平：诸暨市超泽横器设备有限公司；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

将市场上购买的白芸豆去除杂质，在4℃水中浸泡12 h后去皮，在35℃烘箱中干燥后经粉碎机粉碎，过100目筛得白芸豆种子粉末。经过上述处理的样品装入聚乙烯袋中在4℃冰箱内保藏备用。

1.3.2 α-淀粉酶抑制剂的提取

称取5 g的样品，按照一定料液比加入蒸馏水，在恒定的温度下不断的搅拌使其充分溶解。通过加入0.5 mol/L NaOH或0.5 mol/L HCl来调节水解液的pH值。然后将水解液于10 000 r/min的条件下离心20 min，合并上清液。并且用DNS比色法[7-10]测定其中还原糖的含量。

1.3.3 葡萄糖标准曲线的制作

取6只试管依次加入0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的葡萄糖标准溶液（3 mg/mL），制成质量浓度依次递增的系列标准葡萄糖溶液，充分混匀后加入2 mL DNS试剂，于沸水浴中反应5 min。流水冷却，各管定容至25 mL。以管1为空白对照，在470 nm波长下测各管的吸光度值。

1.3.4 样品测定

参考赵蓉等[11-12]的方法。样品管：精确吸取0.5 mL从白芸豆提取的α-AI和0.5 mLα-淀粉酶溶液，充分混匀，在37℃水浴反应10 min，然后加入1 mL 2%可溶性淀粉溶液，在37℃水浴中准确反应5 min，之后，再加入2 mL DNS显色剂，在沸水浴中反应5 min，之后立即用流动自来水冷却（终止反应），适量稀释，在波长470 nm处测定吸光度值，记为OD470nm。对照管：用蒸馏水替代α-AI，其他条件同上，记为OD′470nm。空白管：用蒸馏水替代α-AI和α-淀粉酶，其他条件同上，调零。α-淀粉酶抑制剂抑制率的计算公式如下：

式中：OD470nm为样品管的吸光度值，OD′470nm为对照管的吸光度值。

1.3.5 提取条件优化单因素试验[13]

准确称取20份5g白芸豆粉，分别按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）加蒸馏水，调溶液pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，分别在20℃、35℃、50℃、65℃、80℃水浴条件下搅拌浸提1.5 h、2.5 h、3.5 h、4.5 h、5.5 h。粗提液倒入离心管中，于离心机中4℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液，测定α-淀粉酶抑制剂抑制率，考察料液比、pH值、提取时间及温度对α-AI抑制率的影响。

1.3.6 响应面试验设计

在单因素试验基础上，采用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken，以料液比（A），pH值（B），提取时间（C），提取温度（D）为主要影响因素，以α-AI抑制率（Y）为响应值，设计4因素3水平共29个试验点，所有的试验随机进行，每组试验至少重复3次。响应面试验设计因素水平编码如表1所示。每个因素被编码为3个水平（-1，0，1）。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的制作

以葡萄糖标准溶液质量浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图1。

由图1可知，标准曲线回归方程为y=1.349 9x-0.018 8，相关系数为R2=0.997 1，表明葡萄糖的质量浓度与吸光度值在0.6～3.0 mg/mL范围内有良好的线性关系。

2.2 提取条件优化单因素试验

2.2.1 料液比对α-淀粉酶抑制剂抑制率的影响

由图2可知，随着料液比的增加，提取液中α-AI抑制率先增大，后减小。在料液比1∶30（g∶mL）时α-AI抑制率达到峰值，之后α-AI抑制率却有所降低，究其原因可能是由于料液比的增加，活性物质在两相中浓度差增大，活性物质溶出增加，α-AI抑制率增加，但随着活性物质溶出达到平衡，料液比继续增加，活性物质在提取液中的浓度被稀释而降低，从而导致提取液α-AI值降低。因此提取料液比在1∶30（g∶mL）适宜。

2.2.2 不同pH值对α-淀粉酶抑制剂抑制率的影响

由图3可知，随着pH值的增加，提取液中α-AI抑制率一直减小，在pH值为3时，α-AI抑制率达到最大值，这可能是因为酸性浸提下接近α-淀粉酶抑制剂的等电点，更容易使蛋白充分溶出，能除掉较多的杂蛋白，使浸提液澄清；随着碱性的增强，造成了部分蛋白的损失，所以抑制率呈现下降趋势。故pH值选择为3.0适宜。

2.2.3 浸提时间对α-淀粉酶抑制剂抑制率的影响

由图4可知，随时间的延长抑制率先上升后平稳，时间＞2.5 h后抑制率增加幅度不明显。说明随着时间的进行，蛋白质的溶出率逐渐趋于稳定，活性成分在细胞内外浓度逐渐达到平衡。从提取提效果和实验周期2方面考虑，浸提时间选择在2.5 h比较合适。

2.2.4 浸提温度对α-淀粉酶抑制剂抑制率的影响

由图5可知，温度对提取液α-淀粉酶抑制剂抑制率的影响较大，当温度在20～50℃时，抑制效果增高明显，50℃时抑制效果达到最大值；从50～80℃，抑制率有所下降。这说明适度的增加提取液的温度可以提高抑制效果，但加热浸提过程中当温度过高时，可能会导致部分α-淀粉酶抑制剂结构改变，α-AI活性成分会部分失活，因此提取温度为50℃较合适。

2.3 响应面法优化提取条件

2.3.1 响应曲面试验设计与结果

在单因素试验的基础上，以抑制率为（Y）为响应值，用Design-Expert 8.0软件设计响应面试验方案，以料液比（A），pH值（B），提取时间（C），提取温度（D）为主要影响因素，响应面试验设计及结果见表2。对该回归模型及其系数进行显著性检验，结果见表3。

运用Design-Expert 8.0数据统计分析软件对表2试验结果进行多元回归拟合，拟合所得白芸豆α-AI抑制率（Y）的多元二次回归方程如下：

由表3可知，模型的F值为48.33，P＜0.000 1，说明该模型极显著，可较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取参数。失拟项在0.05水平上不显著（P=0.065 2），说明残差均由随机误差引起。模型校正决定系数R2Adj=0.945 9，说明模型能解释94.59%响应值的变化；模型的复相关系数为R2=0.973 0，说明该模型与实际拟合较好，故适用于提取工艺条件的预测。其中模拟一次项B、C项、二次项A2、B2、C2、D2项及交互项AB、BC项对白芸豆α-AI抑制率有极显著影响，而AD对白芸豆α-AI抑制率值有显著影响，其他因素影响不显著。

2.3.2 响应面分析

响应面分析（response surface analysis，RSM）法按照参考文献[14]采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，将多因子试验中因子与指标的相互关系用多项式近似，依此可对函数的响应面和等高线进行分析，当得到的曲面较为平缓，等高线密度较为稀疏，则各个试验变量对响应值的影响显著性很小；当曲面较陡，等高线密度较大，证明该条件下的各个变量对试验的响应值影响比较显著，试验的响应面及等高线见图6。

由图6可知，随着各因素水平的升高或延长，α-AI抑制率先增加后减少。根据图6A、6B、6C的曲面图的陡峭程度显示，可得出料液比对提取率的影响要小于pH和提取时间，但大于提取温度；同理，图6D、6E的曲面图显示pH对α-AI抑制率的影响要弱于提取时间，强于提取温度；图6F响应面图显示提取时间对α-AI抑制率的要大于提取温度。再次验证了单因素与交互作项对α-AI抑制率的影响的主次顺序。

通过响应面软件的优化程序模块对提取条件进行优化，结果如下：料液比1∶30.056（g∶mL），提取时间2.66 h，pH值为3.6和温度50.14℃，在此条件下模型预测α-AI抑制率可达到95.435%。

2.3.3 验证试验

实际操作过程中选择料液比1∶30（g∶mL），提取时间2.7 h，pH值为3.6和温度50℃，进行3次试验，得到的α-AI抑制率的平均值为（94.9±0.656）%。结果表明，模型预测值与试验实际值相对偏差较小，说明本试验所选模型具有很高的拟合性，该模型能较好的预测白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的抑制率，可用于指导生产实践[15-16]。

3 结论

利用Design-Expert 8.0.6统计软件，选用Box-Behnken试验优化白芸豆中α-淀粉酶抑制剂最佳条件为料液比1∶30.056（g∶mL），提取时间2.66h，pH值为3.6和温度50.14℃，该条件下经模型预测得到的α-AI抑制率为95.435%，实际试验值为（94.9±0.656）%，与预测值基本一致。

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Extraction technology of α-amylase inhibitor from white kidney bean

CHENG Min,TIAN Tongtong,LI Tian,ZHU Xinrong,ZHANG Jian*
(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Using white kidney bean as material,theα-amylase(α-AI)inhibition activity in white kidney bean was determined by 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)colorimetry.Based on single factor experiment,the interaction effect of solid-liquid ratio,pH,extraction time,and temperature onα-AI rate were optimized using response surface methodology.The optimum extraction conditions were as follows:solid-liquid ratio 1∶30.05(g∶ml),pH 3.6,time 2.66 h,temperature 50.14℃based on the prediction model.Under these conditions,theα-AI rate of extraction solution was 95.435%.The established regression model were highly significant(R2=0.973),which can be used for the prediction ofα-AI rate in white kidney bean.

white kidney bean;extraction;α-amylase inhibition rate;response surface analysis

Q51

A

0254-5071（2015）06-0089-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.020

2015-05-25

石河子大学青年骨干教师培训项目（3152SPXY01027）

程敏（1992-），女，本科生，研究方向为食品质量与安全。

*通讯作者：张建（1979-），男，副教授，博士，研究方向为食品生物化学。