白酒酿造体系厌氧微生物研究进展

曾 超，邱树毅，胡宝东，陈美竹，徐 佳，王晓丹，3*

（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025）

白酒是我国传统的蒸馏酒，是世界七大蒸馏酒之一，在白酒酿造过程中，无论是液态、半固态，还是固态发酵法，在进行堆积、发酵过程中，经过不断地驯化和发酵，酒醅和窖池都会形成独有的适合厌氧微生物生长的厌氧环境，厌氧微生物不断地代谢繁殖生长，进而形成一系列厌氧微生物体系，在堆积、发酵过程中必然发挥着重要的作用，由于厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢以无氧发酵的方式进行，在发酵过程中会产生乙醇、乳酸、己酸等，就必然会影响酿酒体系中的pH值和白酒的风味。因此对白酒酿造体系中酒醅和窖池的厌氧微生物的研究是很有现实意义的。然而由于厌氧微生物在有氧存在的情况下基本不生长或者死亡，对厌氧微生物的厌氧环境很难保证，这就给分离筛选出纯种厌氧微生物带来了更大的困难。直到最近二十年，由于自动厌氧手套箱的出现，再加上新技术新方法的应用，对厌氧微生物的研究取得了很大的进展，并获得了一系列丰硕的成果[1]。

厌氧微生物是一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的微生物，一般主要是细菌。霉菌和酵母均是好氧或兼性厌氧菌[2]。厌氧微生物主要可分为两大类[3]：一类是革兰染色阳性有芽胞的厌氧芽胞梭菌，另一类是无芽胞的革兰阳性及革兰阴性球菌与杆菌。前一类因有芽胞，抵抗力强，在自然界（水、土等）、动物及人体肠道中广泛存在，并且能长期耐受恶劣的环境条件，在窖泥、酒醅中均有发现；后一类则是人体的正常菌群，可与需氧菌、兼性厌氧菌共同存在于口腔、肠道、上呼吸道、泌尿生殖道等，这类无芽胞厌氧菌的致病性属于条件致病性的内源性感染，在长期使用抗生素、激素、免疫抑制剂等发生菌群失调或机体免疫力衰退时，或细菌进入非正常寄居部位时才可致病。本文主要对现阶段厌氧微生物的培养技术及其白酒酿造体系厌氧微生物的研究现状做概述，为相关研究的顺利开展提供理论依据。

1 厌氧微生物培养技术的研究

厌氧菌培养日益引起临床细菌检验人员的重视。厌氧曲培养的一个关键性问题就是厌氧条件是否合格，只有厌氧条件合格才能提高厌氧菌的分离率[4]。目前厌氧微生物的培养技术主要有平板厌氧技术（主要包括平皿夹层厌氧法、平板培养瓶厌氧技术）、亨盖特（Hungate）滚管技术、厌氧手套箱技术等。

1.1 平板厌氧技术[5]

1.1.1 平皿夹层厌氧法

平皿夹层厌氧法具体操作是：将琼脂培养基灭菌后，倒入平板中（三分之一左右），再将不同梯度的菌悬液分别取0.1 mL涂布于平板上（同好气操作），让菌悬液渗透10 min，再倒入琼脂培养基至刚好未溢出的状态，盖上皿盖并下压，排除皿内的气泡，使其达到严格厌氧状态，并用琼脂密封皿口培养。穆军等[6]结合常规好氧细菌和严格厌氧细菌分离纯化方法的优点，设计了平皿夹层厌氧法，并将之成功地运用于硫酸盐还原细菌（严格厌氧）和脱氮硫杆菌（兼性厌氧）菌株的分离纯化。

1.1.2 平板培养瓶厌氧技术[7]

平板培养瓶厌氧技术是利用宽体窄颈瓶形成培养瓶底部的平面，进行菌液涂布或滴加菌滴并轻摇涂布法，用氮气吹脱培养瓶内空气（氧气）。配制培养基过程中，利用加热煮沸驱逐液相溶解氧和利用氮气吹脱瓶内气相空气的方式，保证严格厌氧，加琼脂0.2%～0.5%，吸收多余水分。全部实验操作采用吹氮气脱氧和加热驱氧法。韩静等[8]通过利用简单的酸处理与热处理相结合的方法，并结合平面厌氧操作技术与培养瓶厌氧技术，成功的分离得到了一株高温产氢菌。此菌在45～50 ℃范围内具有较强的产氢能力。此菌为高温产氢菌，并且在85 ℃下处理10 min后仍然具有一定的活性，这有利于简化菌种的纯化，但是操作繁琐，厌氧环境不易控制，很难达到厌氧菌的生长条件。该方法虽然能分离出严格厌氧菌，但使用并不广泛。

1.2 亨盖特（Hungate）滚管技术

亨盖特厌氧滚管技术主要原理是管内的铜柱不断被氧化被还原以实现除氧的目的，达到无氧状态。与亨盖特厌氧滚管技术相比，厌氧袋、厌氧罐的除氧效果不太理想，很难保证厌氧微生物所需的无氧状态，厌氧箱价格昂贵，设备维护费用较高。亨盖特厌氧滚管技术是一种能够达到无氧状态，操作较简便的理想的分离筛选各种厌氧微生物的方法。李平兰等[9]成功利用亨盖特厌氧滚管技术检测双歧杆菌制品中的活菌数。邓功成等[10]采用亨盖特厌氧滚管技术，从厌氧消化器中分离得到严格厌氧微生物甲烷菌。结果显示，亨盖特厌氧滚管分离培养技术方法可靠，分离的效果好，适用于各种严格厌氧微生物的分离纯化。

1.3 厌氧手套箱技术[11]

手动厌氧箱：其操作是关闭交换室内门，外门打开，将物品放入交换室，再关闭外门，启动抽气泵，抽去箱内的空气，待压力计指针接近不动，关闭抽气泵，打开箱内进氮气按钮，待氮气充满操作室时，关闭箱内进氮气按钮，再打开抽气泵，如此循环3～5次后，再打开室内混合气按钮，充进混合气，过道同室内操作相同。操作完毕后，打开内门，将物品放入操作室，关闭内门，打开外门，取出物品。再进行室内和过道混合气微调，使厌氧工作站达到厌氧状态。该方法操作繁琐，每次放样都要进行几次抽气、换气，从而消耗气体量很大，操作过程不是直接接触仪器，而是通过厌氧手套来进行，操作难度大，而且厌氧手套箱价格较昂贵，成本较大，不适宜进行厌氧菌的分离。

自动厌氧手套箱：一旦仪器安装完毕，只要打开启动按钮，操作室的换气操作可自动进行，只需厌氧指示剂来指示其是否达到厌氧状态，操作极其简单。虽然该方法消耗气体较多，成本较大。该方法能够克服厌氧环境难以形成的问题，操作及其培养都在厌氧手套箱中，能够直接通过手与仪器接触进行操作，操作方便，较前面几种方法更容易培养出严格厌氧菌。该方法适用于酒醅、窖泥中厌氧细菌的分离纯化。

2 白酒酿造体系厌氧微生物的研究现状

在白酒酿造中，根据微生物学研究，分析出酒曲以霉菌、酵母的作用为主[12]，对酒曲中的厌氧微生物尚未见报道。而窖泥以细菌的作用为主，主要为乳杆菌和己酸菌，酒醅中的微生物主要来自酒曲及窖泥，受环境影响大、菌群复杂。以下主要对在白酒酿造中，窖泥、酒醅中的厌氧微生物做了简单的概述。

2.1 窖泥厌氧微生物的研究

传统浓香型大曲酒采用泥窖发酵，其原因就是窖泥中栖息着大量的微生物，窖泥微生物的种类、数量、种群间的相互作用以及代谢的多样性直接影响着白酒的质量[13]。在浓香型白酒窖池微生物类群中，以细菌的作用为主，且大多为厌氧及兼性厌氧菌，其中对白酒香气形成贡献最大的是梭状芽孢杆菌，其主要代谢产物是己酸、丁酸和氢。此外，还有异养菌、多种产甲烷菌、甲烷氧化菌、乳酸菌、各类发酵菌等，且发现己酸菌和甲烷菌共生时可促进己酸的生成。由此可见，影响浓香型白酒香气产生的主要微生物表现为厌氧菌和兼性厌氧菌[14]。

易彬等[15]通过对不同窖龄窖泥微生态变化研究表明：窖壁泥的好氧细菌数量和窖底泥的好氧芽孢细菌数量均随着窖龄的增加呈逐渐降低趋势，而窖壁泥的好氧芽孢细菌数量和窖底泥的好氧细菌数量均随着窖龄的增加呈先降后升的趋势；窖底泥的厌氧细菌和厌氧芽孢细菌以及窖壁泥的厌氧芽孢细菌数量随着窖龄的增加呈逐渐增加的趋势，不同窖龄的窖壁泥的厌氧细菌数量没有明显差异；不同窖龄的窖泥的好氧细菌、好氧芽孢细菌、厌氧细菌以及厌氧芽孢细菌数量总趋势为窖底泥显著高于窖壁泥；不同窖龄的窖泥中的霉菌和酵母菌数量均较少。赵辉等[16]从东北地区某酒厂优质窖泥中采用兼性厌氧培养及微量成分分析的方法，分离筛选出3株（C78、a57、A17）高产己酸的兼性厌氧细菌，其产己酸量分别为：213.691 4 mg/100 mL、170.465 mg/100 mL、103.509 7 mg/100 mL。经形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定其分别为：巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、梭状芽孢杆菌（Bacillus fusiformis）及地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。徐占成等[17]从剑南春老窖泥中分离到产己酸的一株菌株，经过贝劳格微生物鉴定系统鉴定为“Clostridium cocleatum”即耳涡形梭菌。耳涡形梭菌是生成己酸的主要菌种之一，该菌种的生理生化特性上与克拉瓦氏菌有明显的不同，在分类学上也有较远的距离。并不与甲烷菌互利共生，普遍存在于浓香型窖泥中，耳涡形梭菌是至今行业内首次确定己酸菌的科学名称，是我国酿酒行业的重大发现。为了认识窖泥厌氧微生物，王赞等[18]从浓香型白酒窖泥中分离筛选出3株厌氧细菌，对其进行菌落形态观察、显微镜观察细胞形态和对其进行生理生化检测，参照《伯杰细菌鉴定手册》对3株厌氧菌进行初步鉴定，并确定其分别为：乳杆菌属（Lactobacillus），束村氏菌属（Tsukamurella），芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus）。

2.2 酒醅厌氧微生物的研究

酒醅是已发酵完毕等待蒸的物料，其微生物菌系来自于酒曲、窖泥以及现场生产环境。由于中国传统固态发酵白酒生产的工艺特殊性，以及相关研究技术及手段受生产地域、发酵周期、产品风格等多方面因素的限制，加之酒醅微生物区系研究的鉴定工作量相当浩大，对其探讨相对较少[19]。酒醅在窖泥微生物的不断驯化下，也逐渐形成了独有的厌氧微生物体系，对于酒的风味起着不可替代的作用。

酒醅微生物区系是白酒酿造体系中微生物多样性研究的重点，其产生的酶类、脂类、酸类构成了酒体风味物质的前提[20]。学者对泸州老窖、五粮液等著名浓香型白酒的糟醅微生物进行了比较深入的研究，成功运用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）及指纹图谱技术监测酒糟微生物区系的分布、消长等动态变化过程[18]。结果表明，细菌多分布于酒醅上层，酵母菌及厌氧细菌主要分布于酒醅下层，霉菌较少；好氧细菌、兼性厌氧细菌、霉菌和酵母菌的数量在发酵初期增长较快，各类微生物的数量随着发酵的进行均有所减少；在发酵中期，兼性厌氧细菌、酵母菌先后成为优势菌群；临近出窖时，酵母菌数减少，芽孢杆菌数增加，发酵后期基本上已不能检出霉菌[21]。

李光辉等[22]利用贝劳格（BIOLOG）自动微生物鉴定系统对浓香型白酒酒醅微生物群落代谢进行分析。结果表明，入窖发酵2～4周期间，下层酒醅微生物群落代谢活性呈先降后升的变化趋势，功能多样性呈先升后降的变化趋势，而且酒醅微生物功能多样性的增加与pH值的显著降低之间也存在着一定的联系。吴衍庸等[23]采用甲烷菌、己酸菌二元发酵技术培养窖泥时，结果表明两菌具有互利共生的关系，在培泥反应中，两株菌的数量都有所增加。目前，利用己酸菌培窖的微生物技术已经在全国范围内推广[24]，而泸州老窖酒曲试验结果表明，利用窖泥甲烷菌与己酸菌二元发酵能够提高酒体中己酸乙酯的含量[25]，若以酒体中己酸乙酯含量180 mg/100 mL计，其优质品率可达到总出酒量的80.9%。可见，在白酒酿造体系中，厌氧微生物能有效提高白酒质量，提高总出酒量的优质率。乔宗伟等[26]为了比较准确地把握浓香型白酒发酵过程中酒醅微生物区系的多样性及消长规律，以全兴酒厂正常生产窖池为试验窖，采用特制取样器跟踪发酵过程取样，对窖池酒醅中不同空间位置的微生物区系进行了动态分析，初步弄清了浓香型白酒窖池酒醅不同层面、不同区域微生物数量的分布及变化趋势，并通过形态、生理学特性的分析比较以及16S rDNA、18S rDNA序列分析等，对发酵过程中主要微生物类群进行了分类鉴定。

侯小歌等[27]以河南宋河白酒发酵30 d的糟醅为实验材料，通过富集培养及稀释涂布法分离厌氧及兼性厌氧菌，以菌落计数法确定最佳样品稀释度和适宜的厌氧菌培养方法，并采用形态学和生理生化特性进行种属的初步鉴定。结果表明：厌氧及兼性厌氧菌分离适宜稀释度为10-3，最佳培养方法为抽真空培养法，共分离到5株己酸菌、6株丁酸菌、2株甲烷菌、6株乳酸菌。丁酸菌、己酸菌和乳酸菌革兰氏染色均为阳性，甲烷菌为革兰氏阴性菌。丁酸菌和己酸菌分别归梭菌属（Clostridium）和芽孢杆菌属（Bacillus），甲烷菌为假单胞菌属（Pseudomonas），乳酸菌为芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus）。王莉等[28]通过对酱香型白酒发酵窖池中不同时间的窖底泥及环境土样中的微生物区系构成进行了测序分析，扩增样本中细菌16S rDNA的v6区并采用Illumina高通量测序平台进行深度测序。结果表明，酱香型白酒厂周边土壤中的微生物多样性极其丰富，相比窖底泥中的微生物组成更加复杂。在土壤驯化成窖底泥的过程中，微生物的复杂度逐渐降低，随着窖底泥的不断驯化，乳杆菌科（Lactobacillaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）和瘤胃茵科（Ruminococcaceae）等厌氧微生物逐渐成为主要优势种群。另外，从窖泥底分离纯化得到的菌株肠球菌科（Enterococcaceae）也是白酒酿造过程中酒醅中常见的微生物组分[29]，由此可见，在酱香型白酒酒醅发酵过程中，酒醅与窖底泥中的微生物进行相互渗透和作用。

3 总结与展望

本文对目前主要的厌氧细菌的分离培养方法和在白酒酿造体系中厌氧微生物的研究进行了简单的概述，对几种厌氧微生物的培养方法进行比较，结果显示：自动厌氧手套箱操作简单，分离效果最佳，更加有利于厌氧菌的分离纯化。通过对白酒酿造体系中厌氧微生物的研究，其中主要是厌氧细菌，包括产己酸菌、产甲烷菌，产乳酸菌等菌属对白酒产香产气有很大的影响，深入研究其产香产气的机制是很有必要的，但由于各种环境的限制，由于厌氧微生物的分离和纯种培养的困难，研究厌氧微生物的技术和方法进展又相当缓慢。目前，在白酒酿造过程中，厌氧微生物的研究还处于传统初级阶段，要想深入了解白酒的代谢机理以及厌氧微生物在白酒酿造过程中的作用，还需结合现代高新生物技术[30]。例如利用气质联用法对白酒酒醅中厌氧微生物代谢产物进行分析，测出代谢产物的组分以及各组分的含量，利用高通量分析，可以很好地了解酒醅中厌氧微生物的变化规律，对功能微生物的筛选与鉴定和改善白酒的风味有很大的意义。

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