微生物油脂提取技术的研究进展

钟 琦，吴慧昊，代军飞，牛 锋*

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 理科实验中心，甘肃 兰州 730124）

能源作为现代工业的支柱，是国民经济发展的动力。随着经济的快速发展和生活水平的日益提高，世界各国对能源的要求不断向着经济、环保和可持续发展的方向努力。微生物油脂（microbial oils）又称为单细胞油脂（single cell oil，SCO），即酵母菌、霉菌、细菌和藻类等产油微生物在一定条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和氨基酸等分别作为碳源和氮源，辅以无机盐，在菌体内产生的大量油脂[1]。产油微生物能够高效利用碳水化合物合成微生物油脂，并且大部分微生物油脂可以替代动植物油脂产生生物柴油，从而缓解能源危机[2]。因此，微生物油脂作为可再生的绿色能源和功能性油脂，已经得到越来越多的关注。微生物生产油脂具有众多优点[3-4]：（1）微生物生长周期短，适应性强，代谢旺盛，培养简单；（2）微生物易于遗传物质的改良，能大幅度提高产量的同时，还能得到符合人类需要的功能性脂肪酸，如二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、γ-亚麻酸（gamma linolenic acid，GLA）等；（3）微生物生产油脂可利用农副产品、食品加工的废弃物作为培养基原料，有利于废弃物的再利用和环境保护；（4）微生物油脂生物安全好，毒副作用小；（5）微生物生产油脂不受场地和季节限制，能够连续大规模工业化生产；（6）微生物比高等植物更能有效地积累油脂。

油脂提取技术是决定微生物油脂能否广泛应用的重要因素之一。因此，研究油脂提取相关工艺技术及方法具有重要的应用价值。本文重点对油脂提取技术进行分类介绍，并对其发展趋势进行分析。

1 微生物油脂的组成特点

微生物油脂主要由多不饱和脂肪酸组成，包括亚油酸（leinoleic acid，LA）、γ-亚麻酸、花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸等[5]。这些不饱和脂肪酸对人类的健康具有重要的生理作用，如LA不仅对癌症、粥状动脉硬化具有一定的防治作用，还能参与脂肪的新陈代谢，增强免疫[6]；GLA对粥样动脉硬化、血栓性心脑血管和肿瘤具有预防作用，还对消炎杀菌、降血脂和糖尿病具有一定的疗效[7]；ARA对脂蛋白代谢、血管弹性、白细胞功能、血小板激活等具有重要的调节作用[8]；DHA具有健脑益智、促进神经系统和视觉发育、防治心血管疾病和调节免疫等功能[9]。

多不饱和脂肪酸对人体免疫系统、心血管系统、内分泌系统和神经系统都具有重要而广泛的生理功能。同时，全球性能源短缺及环境恶化使得微生物油脂广泛应用于医药、食品和生物能源等方面。

2 国内外微生物油脂研究现状

国外对微生物油脂的研究工作已有半个多世纪。在20世纪80年代末，英国和日本首先推出含GLA的微生物油脂的功能性饮料、医疗保健食品和高级化妆品[10]。目前，美国、日本和欧洲等国家已有微生物油脂面市。

我国对微生物油脂产业的研究相对较落后，大部分研究还处于实验室或者中试阶段。赵春海[11]用菊芋根块水解液分批补料发酵胶红酵母，其生物量为19.47 g/L，油脂含量达52.2%。孔祥莉[12]利用葡萄糖和木糖混合发酵培养斯达油脂酵母，其生物量为15.8 g/L，油脂含量达58.8%。余增亮等[13]在4×200 m3大容器反应器中发酵由离子束诱变的高山被孢霉，其生物量达38.2 g/L，油脂含量20.67 g/L。提取花生四烯酸后的残油，经过精炼后，还能作为生物柴油。

3 微生物油脂的生产工艺

工业微生物油脂的生产工艺[14]：

筛选菌种→活化菌种→一级种子液→二级种子液→发酵罐生产→收集菌体→菌体预处理→油脂提取→油脂产品的制备

工业化大规模生产微生物油脂的菌株必须具备[15]：（1）具有合成油脂的能力，且油脂积累量大；（2）能进行工业化深层培养；（3）食用安全；（4）生长速度快；（5）油脂易于提取。通过物理、化学和生物诱变等技术改变菌体遗传物质，筛选功能性脂肪酸的高产菌株，已经成为产油微生物定向育种的重要方向。

微生物油脂属于胞内产物，对菌体的预处理是提取微生物油脂的关键步骤之一。微生物具有致密的细胞壁结构，在油脂提取前需要对菌体细胞进行预处理。预处理的方法包括：掺沙共磨法、菌体自析法、酸热法、酶解法、超声波法、反复冻融法和微波法等。预处理菌体细胞，可以使油脂更容易的萃取，缩短萃取时间和成本。

4 微生物油脂的提取方法

4.1 超临界CO2萃取法（supercritical CO2fluid extraction）

以CO2为超临界流体，利用其强溶解性、高扩散性、低黏性，良好的流动性和扩散性等特点，通过调整CO2的温度和压力，可以选择性的进行油脂提取[16]。利用超临界CO2萃取的油脂，不仅具有纯度高、色泽好、无有机溶剂的残留、无污染等优点[17]，而且能选择性的分离不饱和脂肪酸，并保持其生物活性[5]。因此，超临界CO2萃取法是目前常用的微生物油脂提取技术。

王锦秀等[18]采用超临界CO2萃取法，以微藻粉为原料，在萃取压力30 MPa，萃取温度35 ℃和萃取时间180 min的条件下，最大得油率在8%以上。王莉娟等[19]在压力20 MPa，时间120 min和提取温度40 ℃的条件下萃取被孢霉油脂，最大油脂得率为46.08%。

4.2 有机溶剂萃取法（organic solvent extraction）

根据相似相溶原理，油脂易溶于非极性有机溶剂，如氯仿、乙醚和石油醚等溶剂，通过长时间浸泡，将油脂提出。常用的有机溶剂萃取法有氯仿-甲醇法和乙醚-石油醚法。有机溶剂萃取法具有操作方法简单、所需设备简单和得油率高的优点，但是油脂成分纯度较低。

蒿珍珍[20]先用盐酸疏松皮状丝孢酵母的细胞壁，在沸水浴和速冷的条件下破坏细胞壁，以氯仿-甲醇作为萃取溶剂，获得最大油脂得率为32.2%。孙晓璐等[21]采用酸热法破碎细胞，分别以乙醚-石油醚、氯仿-甲醇作为萃取溶剂，结果显示前一方法提取效果优于后者，其油脂得率达29.8%。GALAFASSI S等[22]以未解毒的玉米秸秆水解液作为培养基，采用恒定细胞破碎系统破碎红酵母，再用乙烷∶异丙醇（3∶2）提取油脂，其油脂含量为0.21 g/L，油脂得率为34%。

4.3 索氏抽提法（Soxhlet extraction method）

索氏抽提法作为脂肪提取的经典方法，是利用乙醚等低熔沸点的有机溶剂长时间重复回流，将干菌细胞中油脂全部提出，是实验室常用的油脂提取方法。虽然提取比较充分，但是耗时长，样品处理量少。除了脂溶性脂肪外，还能将磷脂、脂肪酸、固醇和芳香油等提出，使得得到的油脂含量比实际油脂含量偏高[23]。ZHU M等[24-25]都通过试验证明干菌得油率明显高于湿菌得油率。

张鹏鹏[23]提取深黄被孢霉油脂时，得到索氏抽提法在产油量和油脂得率方面均明显高于酸热法，其产油量达6.81 g/L，油脂得率为53.47%。赵春海[11]利用发酵罐分批补料培养胶红酵母菌株，用索氏抽提法提取细胞油脂，其生物量达19.47 g/L，油脂得率为52.21%。

4.4 酸热法（acid-hot method）

酸热法主要是利用酸将由糖和蛋白质等组成的细胞壁结构变得疏松，再在沸水浴和速冷的作用下进一步破坏细胞壁，从而有利于油脂提取。酸热法将破碎细胞和油脂提取结合，提高了油脂提取能力，操作简单、快速，对设备要求不高，且在短时间内可以处理大量样品。

耿青伟[26]比较了不同提取方法对斯达油脂酵母提取油脂效果的影响，结果显示，以酸热法提取油脂的得油率最高，其最高油脂得率为21.36%。孔凡敏等[27]通过酸热法对油脂酵母提取条件进行研究，确定每0.5 g干菌体用10 mL 4 mol/L盐酸沸水浴8 min，再加入10 mL无水乙醇和24 mL乙醚∶石油醚（1∶1），最高油脂提取率为39.87%。

4.5 酶解辅助萃取（enzymatic assisted extraction）

酶解辅助萃取法是利用微生物细胞壁成分的差异，用不同的酶破坏细胞壁，再将油脂提出。蜗牛酶、纤维素酶和溶菌酶是实验室常用于破坏细胞壁的酶。利用酶解处理细胞壁，具有操作简便，条件温和，不会破坏细胞原有的特定油脂成分。

王莉等[25]研究不同油脂提取工艺对产油酵母油脂产率的影响，结果显示，先用10 mg/mL蜗牛酶破碎产油酵母JM-D的细胞壁，再用有机溶剂进行油脂提取的方法最好，最高油脂得率为46.2%。张秋红[28]利用纤维素酶，在pH 4.10，酶解温度37.9 ℃，酶用量0.16%和酶解1.86 h的条件下破坏眼点拟微绿球藻细胞壁，再进行油脂提取，其油脂提取率达（38.69±0.15）%。

4.6 超声波辅助萃取（ultrasonic assisted extraction）

超声波辅助萃取是利用超声波对媒介产生机械振动作用和空化作用，以达到破碎细胞的一种物理破碎方法[29]。超声波破碎细胞的方法简单，且提取率较高。在使用超声波辅助萃取时，需要控制细胞密度，否则会影响细胞的破碎效果[30]。

王敏等[31]采用酸热耦合超声波提取粘红酵母油脂时，在提取液比1.9∶1，酸处理34 min，超声波处理7.5 min的条件下，使1 g湿菌的油脂质量从42 mg增加至57.33 mg，油脂提取率提高了36.5%。马千然[32]在超声波功率1 680 W时，超声处理Y3小球藻细胞15 min，再用有机溶剂萃取，其湿菌体的油脂产量达13.2%。

4.7 反复冻融辅助萃取（repeated freeze-thaw extraction）

反复冻融法是指将待破碎的细胞在-20 ℃条件下迅速冷冻，然后放于室温或更高温度迅速融化，如此反复多次，细胞内形成的冰晶使细胞液的盐浓度增高而引起细胞破碎的方法。操作简单，成本低，可以高密度大规模的提取微生物油脂，但是操作过程比较长，耗费人力。

王莉等[25]将产油酵母菌的菌悬液冷冻12 h后，于沸水浴、室温和微波炉中解冻，反复3次，结果显示沸水浴解冻破碎细胞提取的油脂产率最高，其油脂提取率为43.4%。杜晓凤等[33]通过反复冻融法破碎细胞提取微绿球藻油脂，得到最大油脂提取率为23.86%。

4.8 微波辅助萃取（microwave assisted extraction）

微波辅助萃取主要是利用微波辐射可以使细胞内的极性物质，如水吸收微波而使细胞内温度迅速上升，液态水汽化时产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，使细胞内的成分自由流动，从而再进行油脂提取[34]。微波辅助萃取具有提取时间短、耗能低、安全可靠、成本低和可同时处理多个样品等多个优良特性[35]，但是在微波过程中提取液温度会增加，会导致某些脂肪酸成分损失。

LEE J Y等[36]利用高压均质、陶瓷珠振荡、超声及渗透休克等方法从丛粒藻（Botryococcussp.），小球藻（Chlorella vulgaris）和栅藻（Scenedesmussp.）3种微藻中提取油脂，发现微波辅助对3种微藻的油脂提取率最高。BALASUBRAMANIAN S等[37]以正己烷作溶剂，利用连续微波萃取系统，其油脂提取率达76%～77%。

5 产业化前景及展望

超临界CO2萃取法、有机溶剂萃取法、索氏抽提法、酸热法、酶解辅助萃取、超声波辅助萃取、反复冻融辅助萃取和微波辅助萃取均可适用于实验室环境下微生物油脂的提取，但超临界CO2萃取法需要专业设备，索氏抽提法提取时间较长，且处理量相对较少，工业生产成本较高，不适合工业生产。而反复冻融辅助萃取操作繁琐，耗费时间，在工业生产过程中难以大规模应用。微波辅助萃取和超声波辅助萃取在油脂提取过程中只要控制处理温度，再辅以有机溶剂萃取，可以用于工业大规模油脂生产。在最适pH值和温度的条件下，酶解辅助萃取操作简单，得油率高，也可用于工业大规模生产油脂。

产油微生物的功能性油脂合成及代谢调控机制已经逐渐清晰，油脂提取技术会逐渐向环保、安全和高效的方向发展。如利用现代生物学技术，对油脂微生物进行筛选，以提高其油脂产量和功能性脂肪酸的积累速度。同时，利用现代发酵技术，研究先进的发酵工艺，在降低成本的同时，提高产油微生物油脂产量，为油脂的工业化大规模应用提供基础。

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