现代微生物分类鉴定技术在白酒酿造中的应用

王晓丹，谢晓莉，胡宝东，班世栋，陈美竹，徐 佳，王 婧，邱树毅*

（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；4.河北工程技术学院科研处，河北 石家庄 050091）

白酒为中国传统固态发酵产品，其生产现场的空气、水源、土壤、原材料以及气候等条件与环境微生物的生态构成息息相关，决定了生产现场微生物多样性的自然形成和优化，构成了酿酒发酵酒曲、窖池窖泥以及糟醅发酵过程中微生态环境与微生物多样性的相互关系；而窖池发酵过程中糟醅固、液、气三相复杂的物质代谢和能量传递过程，决定了传统酱香型白酒产品的风格特征。随着现代分子生物学等技术的迅速发展，给传统的微生物分类鉴定带来了巨大的革新。在传统的微生物实验鉴定技术的基础之上，利用分子生物学的发展成果，通过对决定生物表型特征的遗传物质（即核酸）进行分析，建立一种客观的、可信度高、重复性好、分辨能力高、灵敏、快速的分类方法，从而使微生物鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定，这在一定程度上弥补了传统微生物鉴定的缺陷。现代分类鉴定技术使得白酒微生物生态学及传统工艺技术与酒体风味特征的形成等领域，取得突破性的进展，研究白酒在大曲发酵、酿造过程微生物多样性构成及变化规律，将现代生物技术与传统微生物培养技术研究方法有效结合，并应用到发酵工艺中，构建能反映白酒生产体系微生物多样性变化、相互关系的微生态信息库，解释白酒的发酵动态、微生物菌群与酒质的关系，获得白酒发酵过程窖池微生物菌群构成及物质代谢基础数据，形成对传统白酒固态发酵机理的最新认识。

1 基因序列的同源性分析技术

基因序列的同源性分析是利用测序结果与基本本地队列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）中的已知序列进行对比，分析同源性，从而对目的菌株进行鉴定。

1.1 16S rRNA/rDNA序列分析

16S rRNA/rDNA序列分析已经成为了细菌种属鉴定和分类的标准方法。通过将待测菌株的16S rDNA序列进行扩增、测序并进行数据的同源性比对分析。然后按照一定的标准，把测序结果分成若干个操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。然后将OTU所代表的序列提交到GenBank BLAST数据库中，通过寻找相似度最高的16S rDNA序列，并构建系统发育树，就可以对菌株进行准确、迅速而科学的定位[1-2]。曾驰等[3]对白云边酒高温堆积酒醅过程中的6株不同细菌进行了分类鉴定，根据16S rDNA序列进行系统发育分析，发现其主要是芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌。张文学等[4]运用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增技术和16S rDNA序列同源性分析等方法测定发酵60 d的糟醅中原核微生物的16S rDNA基因全序列。真细菌主要分为6个菌群，古菌主要为产甲烷古细菌。张霞等[5]从贵州浓香型白酒窖泥和酒醅中分离到了477株细菌，通过16S rDNA序列分析发现，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）在芽孢杆菌属中占主导，其总数可以达到32.96%。还有一些不确定的芽孢杆菌和极少量的短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）的不确定菌株。与四川酒厂的微生物类群相比后，发现有些许差别。汤斌等[6]采用PCR扩增技术、分子克隆技术以及序列同源性分析等方法测定安徽古井贡酒酒厂窖池底层窖泥细菌的16S rDNA，通过与基因数据库中相似菌群序列同源性的比较，得到样品菌种多样性，分别构建系统发育树。结果显示，细菌含有几大类群，表现出高度的细菌多样性，共分为不可培养细菌（uncultured bacterium）、梭菌属（Clostridium）、乳杆菌属（Lactobacillus）、真杆菌属（Eubacterium）和Syntrophomoua五个细菌分类。刘森等[7]采用16S rRNA基因克隆文库技术对四川某浓香型白酒股份有限公司20年窖龄的窖池不同层面的窖泥进行分析，其中细菌类群及数量的差异性较大。优势菌群梭菌属细菌（Clostridium diolis）及耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）在上、中、底层窖泥中所占比例分别为34.9%和39.8%、25.2%和20.6%、23.8%和36.6%，枯草芽胞杆菌枯草亚种（Bacillus subtilissubsp.subtilis）是中层窖泥优势菌群之一，占22.1%；古细菌群落主要分布在甲烷囊菌属（Methanoculleus）和甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）。Methanoculleus bourgensis在上层和底层窖泥中所占比例分别为89.9%和88.2%。Methanosarcina siciliae和Methanoculleus bourgensis在中层窖泥中所占比例分别为40.7%和49.1%。系统发育分析显示：窖泥细菌主要为杆菌目、梭菌目、肠杆菌目及以TM7 phylum sp.为代表的种属分类尚不明确的细菌，古细菌主要为甲烷微菌目与甲烷八叠球菌目，其中可能存在这些微生物新的种或亚种。LI X R等[8]根据16S rRNA文库，内转录间隔1区条形码焦磷酸测序和实时定量PCR技术分析了汾酒一个轮次夏季发酵酒醅中超过16S rRNA基因总序列的91%属于乳酸杆菌科，其中有51%的为耐酸乳酸杆菌，其与检测到的化学成分有相似显著性变化，60%真菌序列归属于酵母科，60%内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）区基因序列归于酵母菌科，大多与东方伊萨酵母非常相似，其与乙醇和有机酸的成分变化趋势相似，第二大类的酿酒酵母，是产乙醇重要的种类，而且大约四分之一属于复膜孢酵母科。相反，有很少部分序列的霉菌，在发酵过程中，实时定量PCR（quantitative real-time PCR，RTQ-PCR）显示，细菌群落有增长趋势，而真菌更加稳定。

1.2 18S rRNA/rDNA序列分析

原核生物细胞中的16S rDNA和真核生物细胞中的18S rDNA的碱基序列都是十分保守的，并且不受微生物所处环境条件的影响。因此，通过分析比较微生物种之间16S rDNA和18S rDNA的同源性，可以真实的揭示它们的亲缘关系和系统发育地位。对于真核生物而言，18S rRNA可以鉴定其系统发育地位。

运用18S rDNA克隆分析技术鉴定到糟醅中心样品真菌为主要优势菌；伊萨酵母属（Issatchenkia）属酵母菌主要出现在发酵前中期，蓝状菌属（Talaromyces）霉菌主要出现在发酵前期，而曲霉属（Aspergillus）霉菌和散囊菌属（Eurotium）霉菌从发酵中期开始增多到中后期占绝对优势。主要优势真菌的菌群变化及生物学特征说明其代谢活动与浓香型白酒糟醅发酵中大分子物质的降解及白酒风味物质的形成密切相关[9]。刘念等[10]对四川中西部名酒厂老窖池上层和下层糟酷进行18S rDNA序列同源性分析发现，白酒糟醅中真菌的优势菌为酵母属（Saccharomyces）、伊萨酵母属（Issatchenkia）、假丝酵母属（Candida）、汉逊酵母属（Hansenula）和曲霉属（Aspergillus）；白酒酒醅发酵前后均以丝状真菌为主，且上层糟醅比下层糟醅菌群丰富。发酵前中期的优势菌为酵母属（Saccharomyces）、伊萨酵母属（Issatchenkia）酵母菌和曲霉属（Aspergillus），发酵后期的优势菌为假丝酵母属（Candida）、汉逊酵母属（Hansenula）酵母菌和散囊菌属（Eurotium）。

2 以PCR为基础的DNA指纹图谱分类鉴定技术

由于近年来生物学在分子水平的发展，尤其以PCR为基础的技术进步，使微生物的分类鉴定进入了分子水平，与传统的分类鉴定相比其更能准确、快速地达到鉴定效果，并能鉴定出更多的未知微生物。目前应用以PCR为基础的DNA指纹图谱鉴定技术有很多，主要有变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DEEG）技术、温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TEEG）技术、单链构象多态性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP）技术、末端限制性片段长度分析（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）技术、荧光PCR技术、实时定量PCR技术等。其中DEEG技术、SSCP技术、T-RFLP技术在霉菌的鉴定中是比较常用且很有效的分类鉴定技术。

2.1 PCR-DGGE克隆分析技术

PCR-DGGE即聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术。其中PCR反应是用来在体外特异性扩增目的片段的技术。DEEG的原理是通过将变性剂甲酰胺和尿素添加到聚丙烯酰胺凝胶中，来形成一个从低到高的线性梯度。由于DNA在同一温度中的解链速率不一样，则电泳迁移率也不同。由于迁移速率的不同，因而可以使序列不同长度相同的DNA片段得到分离。凝胶条上DNA条带的强度和数量可以反映出微生物群落结构的多样性。然后可以将条带中所含有的DNA进行PCR扩增、测序以及与数据库中数据比对，通过聚类分析，就可以对微生物进行分类鉴定[11]。温度梯度凝胶电泳（TEEG）是DGGE技术发展出的衍生技术。在研究清香型白酒大曲酵母菌群落结构时从大曲中共检测7个真菌分类属微生物[12]，在研究汾酒大曲细菌群落结构时，得知品温控制的高低对3种汾酒大曲中细菌的种类多少和数量大小的影响较大[13]。

研究DGGE/TGGE胶中单一条带序列组成的一个比较普遍的方法是先构建整个微生物群落的16S rRNA克隆文库，然后再对文库中的克隆进行扩增，通过DGGE/TGGE和原始样品的条带进行对比，能迁移到相同位置处的克隆序列就是原始条带所含的序列。利用16S rDNA分析和PCR-DGGE技术来对酱香型白酒酒醅中乳酸菌群进行分析，对浓香型白酒酒醅微生物进行研究，对江苏某酒厂两种香型的2个生产用窖池的微生物进行研究对比了微生物菌群结构。DGGE图谱分析显示和通过16S rRNA克降文库的测序结果在数据库中的比对，鉴定出在白酒曲药和酒醅的研究中尚未报道的细菌属[14-15]。

2.2 单链构象多态性分析（SSCP）技术

SSCP技术是根据DNA或RNA的单链构象具有多态性的特点，结合PCR技术对基因检测的分析技术，它用于分析微生物的基因突变和遗传学特征。由于霉菌全长ITS区序列包含了其两端的18S rDNA、28S rDNA的部分序列和中间的ITSl区、5.8S rDNA、ITS2区的完整序列，拥有相对丰富的信息，因而全长序列的ITS分析在霉菌分子生物学鉴定中比较常用[16]。分析鉴定方法同ITS区的一样。通过PCR-SSCP技术分析泸州老窖窖泥中不同窖龄浓香型白酒窖池细菌群落的变化规律，可以敏锐的将有差异的分子构象分离，从而对细菌进行分类鉴定[17]。利用SSCP技术可以发现一些在传统培养技术中没有分离得到的原核微生物种群，对浓香型大曲原核微生物群落的PCR-SSCP研究中每个泳道均出现6～8条比较清晰的条带，每一条SSCP谱带中可能同时含有很多类不同的菌群，这样导致比通过传统培养得到的微生物类群要少。这个问题是以基因指纹技术为基础的群落分析方法无法避免的，这一弱点可以通过大量的克隆测序加以克服。PCR-SSCP技术在研究原核微生物群落变化情况和评价微生物群落结构的变化上有直观、方便和快捷的优点[18-19]，但SSCP图谱与群落实际结构符合程度有待提高，这主要是由基因组DNA提取方法和PCR选择性放大造成的偏差[20]。用现代分子生物学技术结合传统的培养纯化法在分析复杂的微生物群落结构时可能结果更为准确。

2.3 末端限制性片段长度分析（T-RFLP）技术

T-RFLP是一种分析生物群落的指纹技术，用于鉴定分析不同微生物群落结构以及它们的多样性。方法是将真菌或细菌设计一对合适的引物，并用荧光物质对引物的一端进行标记，经PCR扩增和酶切后用特定的自动测序仪进行测序。根据检测到的带有荧光标记的DNA片段与相应数据库进行比对判断微生物区系多样性，可以鉴定到微生物种和属；根据荧光强度的强弱可以确定该种的丰度。

该技术不仅可以进行微生物类群的定性分析，而且可以定量分析，现在已经应用于微生物的多样性研究。目前，T-RFLP技术已经应用于大曲、酒醅和自然环境中微生物的多样性研究中[21-22]。

2.4 扩增片段长度多态性（AFLP）分子标记技术

扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）标记技术是建立在RFLP基础上的选择性聚合酶链反应，利用可产生粘性末端的限制性内切酶酶切研究对象的基因组序列，产生不同长度的酶切片段。将这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的人工接头连接，形成模板，再在模板末段添加具有选择性核苷酸（1～3个）的不同引物，然后PCR扩增，结果只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后将被扩增的片段在高分辨率的测序胶上电泳，这样其多态性即根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。由于多态性存在于整个基因组，所以多态性高，导致检测位点多，与物种多态性具有正向相关性；DNA用量少（50～100 ng），无需Southern印迹杂交，重复性好，由于接头与引物皆为人工特异合成，故不需事先知道研究对象的DNA信息。邓依等[23]利用ITS-AFLP指纹图谱分析技术分析出贵州某酒厂窖壁和窖低的窖泥中的原核微生物在16S-23S rRNA ITS水平上呈现出差异，其中老窖窖底和新窖窖底的原核微生物多样性存在着明显差异，其相关系数为0.47；而老窖窖壁和新窖窖壁的原核微生物多样性却差异不大，其相关系数为1.00。向文良等[24]利用16S-23S rRNA ITS AFLP指纹图谱技术监控四川传统米酒发酵过程中原核微生物的演替，并结合米酒发酵过程中理化因子的动态变化分析了其演替过程。

2.5 荧光原位杂交（FISH）技术

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。

吴冬梅等[25]采用FISH分析了窖泥中的微生物，发现大肠杆菌（Escherichia coli）及植物乳酸杆菌（Lactobacillus planetarium）的定量表征受到生长期的影响，对数期和稳定期的菌体检出率＞82%，衰退期的L.planetarium则明显减少；死菌体比活菌体的检出信号显著减弱；经硫酸铝处理，除去腐植酸的窖泥样品明显地提高了可辨力，加入窖泥中的E.coliFISH检出量为光学显微镜训一数量的46.89%。采用FISH技术可视化定量表征了窖泥中细菌和古菌的特征，有益于从细胞水平研究其微生物群落的关系。

2.6 宏基因组技术

宏基因组技术是直接对样品中所有微生物的全基因组DNA进行克隆，理论上可以获得所有微生物的全基因组序列信息。大曲的生产工艺决定了大曲中微生物具有多样性和复杂性，大曲生产过程所具有多酶多菌酿造的技术特征以及白酒开放式的酿造模式，使我国白酒具有独特的品质风格。宏基因组分析技术可以最大限度地解析白酒中微生物种类及其数量，可以用来分析和研究白酒生产中微生物种类消长变化规律[26]。利用宏基因组学技术可以研究白酒中的可培养和免培养的微生物，它开拓了白酒中微生物的研究领域。利用宏基因组学技术从白酒微生物及酶的关系、整体微生物群落水平两个方面来研究白酒中微生物，从而筛选得到影响白酒发酵的功能酶和功能菌和揭示不同大曲酒的微生物群落多样性及其变化情况。从而较全面了解大曲酒微生物群落的代谢机理和形成大曲酒与众不同的香味组分的构成和风味特征[27]。

3 磷脂脂肪酸法分类

磷脂脂肪酸图谱分析法源于上个世纪70年代末，主要用于微生物的定量分析，成功地克服了传统方法的缺点[28]，可以直接研究微生物中复杂的群落组成及其关系，是一种快捷、可靠的检测方法。测定微生物样品中磷脂脂肪酸的种类和数量可以真实反映出不同微生物类群的潜在繁殖能力。通过气相色谱-质谱图谱峰面积分析还可以对微生物中类群进行定性和定量分析，从而确定微生物中类群的种类和数量，这是磷酸脂肪酸分析法的优势[29-30]。另外，磷脂脂肪酸用来标记活体微生物群落，通常在生物体细胞内被认为是恒定的[31]。因此，磷脂脂肪酸图谱发生改变就可以认为是样品中微生物种类和数量发生了动态变化，即通过磷脂脂肪酸图谱动态分析可以揭示样品中微生物变化过程[32-36]。

4 Biolog微平板

Biolog技术由美国Biolog公司于1989年开发成功，最初应用于纯种微生物的鉴定，至今已经能够鉴定包括细菌、酵母、霉菌在内的近2 000多种病原微生物和环境微生物[37-38]。Biolog微平板可以用于估价微生物群落代谢多样性和功能多样性的研究[39]，与其他鉴定系统相比，Biolog方法在用于环境微生物的研究时，灵敏度高，分辨力强，并且数据的读取和记录可以由计算机辅助完成，自动化和标准化程度增高，简化了鉴定程序，提高了鉴定效率。目前Biolog技术已成为微生物分类鉴定常用的技术手段[40-41]。

5 小结

采用先进的微生物分类鉴定技术，研究中国白酒制曲、酿造环境、酿造过程的微生物，对窖池中的发酵酒醅上、中、下层及不同窖龄的酒醅中微生物进行分类鉴定，了解不同窖龄及不同层微生物的多样性、微生物数量、种类的变化规律。着重分析制曲过程及酒窖内发酵过程中微生物区系的演变规律，力求为白酒的窖池发酵机理提供理论基础。对堆积过程的微生物，特别是酵母、霉菌和细菌的变化差异，为讨论风味物质代谢、酶系、白酒风格特征等研究提供理论基础。

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