中药生物转化技术研究进展

2015-01-26邱智东王伟楠

中国酿造 2015年7期

李洋，邱智东，王伟楠*

（长春中医药大学药学院，吉林长春 130000）

生物转化是化学、生物学和生物工程学的交叉学科，是利用生命体、离体组织、细胞或酶对特定底物进行结构修饰和改造，获得有价值的转化产物以满足化学品、医药、能源和材料等领域需要的一种技术，也是与生命和人类活动关系最为密切的自然现象之一[1-2]。生物转化相对于化学转化而言具有转化效率高、专属性强、能耗低、无污染等优势，目前已广泛的应用到食品和医药工业生产当中[3-4]。现代中药生物转化技术又称中药发酵技术，是在继承传统的中药炮制发酵方法的基础上，吸收微生态学的研究成果，并结合现代的生物转化工程而形成的中药制药新技术[5]。中药生物转化技术主要分为液体发酵[6]和固体发酵两种形式，而在传统固体发酵的基础上，又发展出了药用真菌双向固体发酵技术[7]。目前，国内外科研人员围绕中药生物转化领域做了大量的研究，一些工作也取得了非常显著的成果，因此，本文拟从技术应用的角度对该领域近几年的研究进展进行综述，并探讨生物转化技术在中药相关产品开发中的意义和可行性。为中药生物转化技术的推广提供理论支持，为大宗中药品种及传统经典名方的二次开发及深度利用提供新的思路和途径。

1 传统中药生物转化技术

中药生物转化历史悠久，早在1 500多年前，人们就开始采用发酵的方法对中药进行炮制。传统中药发酵形式一般分为两类：一类是药材与面粉混合发酵，如六神曲[8]、半夏曲[9]等；还有一类是药材直接进行发酵，如红曲、淡豆豉、百药煎等[10]。由于传统发酵过程多凭经验进行，缺乏规范性的工艺技术及适宜的监控指标，发酵所得中药产品质量差别较大，难以制定出统一的质量标准和检验方法，无法保证发酵中药产品的安全性和稳定性，且存在着发酵时间长、占地面积大、劳动强度高、卫生条件差等问题，因此，随着现代生物工程技术的发展，不断有研究人员提出新的方法对中药发酵工艺进行革新，而传统的方法逐渐被淘汰或趋于规范。

2 当代中药生物转化技术

2.1 酶发酵技术

酶发酵技术就是利用酶所具有的生物催化功能，改变原料物理化学性质，将其转化生成有用物质的一门技术。新鲜植物采摘之后，在自然条件下放置一段时间就会变质，导致这个过程的主要原因是植物及其内生菌所分泌的酶对原有化学成分进行了生物转化，虽然这种转化的结果是不可预期的，但是通过合理的体外设计，可以利用这些酶去定向改造中药的活性成分，达到增效减毒的作用。喻春皓等[11-12]利用自制复合酶对生晒参95%乙醇提取物、人参茎叶及三七茎叶总皂苷等系列中药有效部位进行了酶发酵，将原生苷转化生成低极性皂苷。这些低极性皂苷具有抗癌、抗衰老、免疫调节等多种药效作用，还具有化学稳定性高、生物利用度好等特点，因此利用这种技术研制的产品具有极大的开发潜力。曹国琼等[13]利用神曲与α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、混合酶分别对化风丹药母溶液进行发酵，测定不同组别间的双酯型生碱类成分即化风丹药母中毒性成分含量的变化，实现了对化风丹药母毒性的降低。欧志敏等[14]利用β-葡萄糖苷酶转化牛蒡子苷，希望能够制备具有治疗或预防慢性肾功能衰竭及肾纤维化、抗病毒、抗肿瘤等功效的牛蒡子苷元，结果β-葡萄糖苷酶成功地将牛蒡子苷转化成了牛蒡子苷元，也为酶法炮制中药牛蒡子提供可借鉴和使用的新方法。李秧针等[15]报道了单宁酶转化没食子酸单宁生成没食子酸和葡萄糖的研究。没食子酸有较强的抗病毒、抗肿瘤等功效，通过酶转化法高效特异性的生产没食子酸，可以为工业生产没食子酸相关产品提供一条重要的途径。还有报道，用酶法转化中药黄芩并提取黄芩的有效成分，发现所提黄芩素和汉黄芩素等苷元的含量较传统方法提取的含量高很多，研究结果为中药的提取方法提供了新方向[16]。酶发酵技术是现代生物转化技术中的重要组成部分，在中药创新研发过程中将具有举足轻重的作用。

2.2 组织发酵技术

药物进入体内后，一般都要经过组织器官的转化才能发挥治疗作用，由此而衍生的将动物组织当作催化媒介的一种的生物转化技术，即组织发酵技术。该技术多是运用组织的整个体系发挥作用，这类技术不仅为中药的生物转化开辟了新方向，而且也对临床用药具有重要的指导意义。隋志刚等[17]曾报道过，利用家兔的肠道对乌头碱进行生物转化，并采用高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）的方法对家兔肠道内的乌头碱代谢产物进行分析，结果表明，乌头碱被转化生成毒性更小的其他生物碱类成分，起到了减毒的作用。同时，有研究表明[18]，复方丹参片经肝脏中肝药酶转化后，所形成的代谢产物会提高人体某种细胞色素450（cytochrome 450，CYP450）酶的活力，而这种酶存在着使致癌物质活化的潜在危险性，因此复方丹参片不宜长期使用。杨秀伟等[19-20]以人肠内细菌为实验模型，将人肠作为转化物质，对芍药苷进行生物转化，并做了一系列的对照、检测试验。研究结果表明，肠内菌是中药进入肠内发生代谢的主要催化物质，起到了改变药性、提高生物利用度等作用，不但在中药有效成分和中药毒性成分的发现上有重要意义，并且在肠内微生态变化相关的疾病治疗上也有着重要的作用。冯培生等[18]利用大鼠肠道厌氧菌群对呕吐毒素进行体外转化，生成脱环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，定量测定结果显示，大肠中盲肠菌群代谢能力最强。刘扬子等[21]利用志愿者的粪便进行了人肠内菌丛培养及其对延胡索甲素和延胡索乙素的生物转化，目的是在于观察延胡索素在人肠内是否能被稳定吸收。通过研究结果表明，延胡索所含主要成分生物碱类化合物能良好地吸收进入体循环，可以作为评价和控制延胡索质量的标示物，为确定延胡索的有效成分及其效应物质提供了人肠吸收方面的科学理论依据。还有关于人体转化中药有毒物质的研究结果表明[22]，在受试条件下根据体内生物转化和代谢不稳定的特性，可以判断出服用药物的原形化合物为毒性成分。实验的意义在于从中药成分的体内过程可以确定毒性效应物质，然后找到原形化合物，为保障中药的安全性和有效性做出了贡献。

2.3 植物细胞培养

植物细胞培养是在离体条件下，将愈伤组织细胞或其他易分散的组织细胞置于特定液体培养基中进行振荡培养，并以扩繁后的细胞体为媒介进行目标代谢产物的合成或转化，以达到提高活性成分含量或增加新的物质基础等目的的一项技术。这项技术主要应用于植物有效成分的生产和生物转化这两个方面。随着人口的激增和人们对自然资源不计后果的开发，很多珍贵植物资源已经灭绝或者正面临着灭绝的危机。利用植物细胞培养来生产植物中的天然有效成分可能将会成为解决这种危机的有效方法。早在1984年日本的Mitsui石化公司就利用紫草的细胞培养技术生产紫草宁，规模达到750 L，产物最终质量浓度达到1 400 mg/L[23]。而近些年来这项技术更是广泛被应用到中药活性成分合成与修饰的领域中。张志强等[24]对海巴戟天细胞进行体外培养，并对培养基进行优化，使得海巴戟天悬浮细胞的生长速率明显加快，蒽醌含量增加，实验结果为中药的细胞培养提供重要参考。王晗等[25]利用植物细胞培养的方法，对台湾金线莲进行发酵培养，获得了药理作用极为广泛的金线莲苷，为大规模发酵生产这种稀缺的野生资源奠定了理论基础。王和勇等[26]通过水杨酸和硝酸银的配伍诱导，实现了植物细胞培养中诱导子之间的协同作用，并成功获得发酵产物紫杉醇39 mg/L，比两个诱导子单独作用时获得紫杉醇最高含量之和还高出50%。李萍等[27]对怀牛膝悬浮细胞进行培养，并对细胞的生长情况和转化产物进行测定，结果表明细胞培养液中的转化产物符合用药标准，可以作为怀牛膝药材活性成分的替代品使用。还有研究表明，培养紫衫植物干细胞能够获得具有抗癌活性的松香烷型三环二萜、美丽红豆杉素A和美丽红豆杉素B，产率较高，为将来临床用药提供物质基础[28]。利用植物细胞培养进行有效成分的合成或修饰活性成分结构，已经取得了令人瞩目的成就。随着这方面研究的不断发展，植物细胞培养这项技术将在生产有价值的植物天然成分方面发挥越来越大的作用，将会有越来越多的天然植物成分可以实现大规模的发酵生产。

2.4 微生物转化技术

微生物转化法是利用微生物在代谢过程中产生的某种或者某一系列的物质能够对相应的中药成分进行加工修饰，起到增效减毒，产生活性成分等作用。如口服人参皂苷类成分的肠内微生物转化[29]。崔磊等[30]从土壤中分离得到所需菌株，对人参进行了直接液体发酵和酸处理后发酵，通过对比发酵前后稀有皂苷含量，结果显示发酵后的稀有皂苷含量明显增加。本研究对利用微生物转化法提高人参的生物活性和制备抗肿瘤稀有人参皂苷均具有重要的指导意义。另有报道，白静等[31]利用酵母菌液体发酵的方法发酵艾叶水提物，研究表明艾叶发酵物对组胺具有拮抗作用，能致豚鼠离体小肠平滑肌收缩，对未来指导临床有着重要意义。TAO J Y等[32]采用白腐菌对6种中药进行发酵研究，通过比较中药发酵前后的降血脂作用的变化，发现有部分中药经过发酵以后降血脂的功效明显增强；戴万生等[33]利用酵母菌发酵大黄后，测定其发酵品中的结合蒽醌的含量较原有含量有所降低，缓和了大黄的泻下作用；朱新术等[34]报道了利用乳酸菌发酵黄芪，提高了黄芪中粗多糖的提取率；刘亮镜等[35]研究发现，用朱红栓菌发酵马钱子，能达到对有毒药材马钱子“去毒”与“存效”并重的目的；李国红等[36]用枯草芽孢杆菌对50种中药进行发酵，并对发酵产物的抗菌活性进行检测，发现部分中药的发酵产物抗菌活性增强、部分中药活性降低、还有部分中药活性不变。

还有一种微生物转化技术是利用植物内生菌对中药进行转化，由于内生菌的优势在于对植物的体内环境较为熟悉，很多与寄生植物具有相同或相近的代谢系统，对绝大多数的植物代谢产物都能够实现结构转化，降低了中药生物转化菌种筛选的盲目性。江东福等[37]在研究中发现，内生真菌对龙血树中血竭的形成具有很强的促进作用，可使血竭的产量提高，而且接种于濒死的龙血树同样可促进血竭树脂的形成和积累。付少彬等[38]报道，从药用植物蛇足石杉中分离内生菌，筛选具有转化乌苏酸能力的菌株，利用内生菌对天然产物乌苏酸进行生物转化。结果证明植物内生菌可以对乌苏酸的结构进行修饰，产生多种多样的物质基础，为进一步开发具有不同药理活性的相关产物提供了方法和技术的支持。王园园等[39]用内生菌转化芦丁，并得到转化物槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，该转化物抗氧化能力很强，可以替代芦丁使用。刘发贵等[40]建立了药用植物内生菌对青藤碱的生物转化模型，从药用植物内生菌中筛选出5株对青藤碱具有转化能力的菌株，得到了不同的转化产物，其研究结果为青藤碱的结构改造和寻找活性更强的先导化合物提供了有效途径。微生物转化技术操作较为简便、易于放大、微生物种类繁多、代谢谱广，是实现中药增效减毒和深度开发利用的关键技术。

2.5 双向固体发酵技术

20世纪90年代，庄毅等[41-43]提出药用真菌“新型”固体发酵（简称双向型固体发酵）概念，即采用具有活性成分的药材或药渣作为基质进行药用真菌发酵，它们之间由于真菌的生长，会产生一系列复杂的分解合成代谢，产生新成分和新功能，使发酵的作用从原来仅由农副产品构成的营养机制提供真菌生长所需要的碳、氮等养分的单向型，发展到应用真菌的生理活动使药性基质中的有效成分发生转化，产生新的成分，从而具有双向型，形成了新型固体发酵。目前只有“双向发酵工程”最能有效的被用来开发药渣，以产生各种有用的药性菌质，它作为一种新资源可继续研发成新药或保健品等[44]。

雷公藤被广泛用于类风湿性关节炎、各种肾病、癌症及系统性红斑狼疮等病症的治疗且疗效显著，然而其不良反应较大，限制了它的应用。张普照等[45-47]运用双向性固体发酵技术，采用多种药用真菌与雷公藤组成发酵组合，对其发酵前后的毒性进行了研究，发现发酵后雷公藤的主要毒性成分雷公藤甲素的量大幅降低，而其生物碱的量变化不大，即降低了雷公藤毒性的同时也保持了雷公藤的药效。张李阳等[48-49]对于药用真菌及其发酵产物对爱拔益加肉鸡（AA肉鸡）的免疫功能的影响进行了研究，发现药用真菌与中药结合的发酵产物能明显提高肉鸡的免疫能力，后期又对发酵工艺中菌质中化学成分的变化进行了研究，为相关菌质新药的开发奠定了基础。潘扬等[50]对马钱子双向固体发酵前后的生物碱的量及高效液相色谱指纹谱的变化进行了研究，也证明双向发酵前后其类生物碱的质和量均发生了明显的变化，为马钱子的减毒增效物质基础的研究做了一定的研究工作。付建国[51]采用大型食药兼用菌，对西洋参进行固体发酵，并测定了发酵产物稀有成分人参皂苷CK、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg3的含量，其含量较西洋参药材提高了几倍至十几倍。双向性固体发酵工程体现了药用真菌与中药材之间的有机结合，二者交叉可形成大量的不同性质的发酵组合，故而双向性固体发酵技术展现了极为美好的前景。

3 结论与展望

不同的生物转化技术具有不同的特点，在当前技术水平下，也存在各自的问题：生命体和离体组织的转化可以从宏观的角度真实反映物质在体内的变化，为阐明中药活性物质基础和功效机理提供有力的支持，但转化过程很难控制，很多物理、化学和生物反应参杂其中，不同生命个体转化差异较大，转化产物比较复杂；酶转化法虽然条件明确、机理清晰、效率高、专属性强，但酶的成本相对较高，对转化条件要求也较为苛刻，很多反应只能在实验室级别实现，故限制了其在工业上的应用；微生物转化技术是在中药生物转化中应用最为成熟和广泛的一种技术，具有成本低、污染小、效率高等特点，在合理的菌种筛选基础上，还可以确保生产和使用的安全性，目前在中国已形成良好的产业基础。

近些年来，中医药越来越被世界所认可和接受，随着丹参等药材的标准进入美国和欧洲药典后，中药国际化脚步也越来越快。在这种情况下，为了确保中药的安全有效性，提高中药产品质量和科技含量，对中药进行炮制和加工显得尤为重要。现代中药生物转化技术为中药的发展带来了新的启发，也解决了许多传统方法没能解决的问题，是中药乃至天然药物活性成分生产与结构修饰所采用的最佳手段之一，也是利用现代生物技术助推中药产业发展的重要途径。通过中药生物转化技术的推广，可以为药材的深度开发、新活性成分的发现、解决药用物质来源不足等问题提供有力的支撑，为推进我国中医药事业的现代化和国际化进程，提升中国民族医药国际竞争力注入强大的活力。

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