乌骨山羊肌肉组织中黑色素来源分析

徐方正，姜勋平*，刘桂琼，谢光跃，张腾龙，王建国，王润申

(1.华中农业大学动物科技学院，湖北武汉 430070;2.湖北多羔育种生物科技有限公司，湖北武汉 430070; 3.通山乌骨山羊育种有限公司，湖北通山 437600)

乌骨山羊肌肉组织中黑色素来源分析

徐方正1，姜勋平1*，刘桂琼1，谢光跃1，张腾龙1，王建国2，王润申3

(1.华中农业大学动物科技学院，湖北武汉 430070;2.湖北多羔育种生物科技有限公司，湖北武汉 430070; 3.通山乌骨山羊育种有限公司，湖北通山 437600)

乌骨山羊肌肉组织中黑色素的的分布、含量和来源是探明乌质性状形成机理的关键。本研究以普通山羊为对照，用多巴组织化学染色法观察背最长肌组织切片中黑色颗粒分布;用酶解法测定乌骨山羊肌肉中的黑色素含量;用紫外可见光分光光度法测定乌骨山羊血清中的褐黑素、碱溶性黑色素和血浆颜色。结果表明:乌骨山羊肌肉组织中存在黑色素颗粒，而普通山羊肌肉组织中没有黑色素颗粒;乌骨山羊肌肉内黑色素含量为0.416%，其含量是普通山羊的7.6倍(＜0.01);乌骨山羊血清中的褐黑素、碱溶性黑色素的含量与普通山羊的并无显著差异(＞0.05);在肌肉组织中没有发现黑素细胞分布。由此推测，乌骨山羊肌肉组织中黑色素是黑色被毛毛囊外根鞘黑素细胞分泌，经血液运输到肌肉组织中沉积，缓慢形成乌骨山羊肌肉的“乌色”性状。

肌肉组织;黑素细胞;黑色素;乌骨山羊

乌骨山羊组织器官中有大量黑色素沉积,呈现出“乌骨乌肉”的种质特征。通常情况下,黑色素主要由黑素细胞合成和分泌。黑素细胞主要分布在皮肤和毛囊中,视网膜上皮、虹膜、眼葡萄膜、软脑膜和内耳中也有少量分布［1-2］。最近在睾丸中也发现黑素细胞分布［3］。黑素细胞的研究热点主要集中在表皮基底层和毛囊组织中。表皮基底层的黑素细胞合成的黑色素主要用于形成肤色,具有光保护作用,使机体免受紫外线伤害［4］;毛囊黑素细胞合成的黑色素主要用于形成毛色,具有广泛的生态适应性［5］。谢光跃等［6］研究发现,黑素细胞在乌骨山羊表皮基底层和毛囊中大量分布,并且黑色被毛的毛囊外根鞘部位的黑素细胞呈现活化状态,即毛囊外根鞘中的黑素细胞大量活化并产生黑色素,是黑色皮肤和黑毛的主要来源。但是乌骨山羊肌肉中的黑色素是否来自毛囊中黑素细胞还不得而知。本实验主要探索乌骨山羊肌肉组织中黑色素的来源,以期为解释乌骨山羊肌肉组织中黑色素沉积机理提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 肉样和血样采集 在通山乌羊育种有限公司羊场随机选取乌骨山羊3只、普通山羊1只,屠宰后分别采集各个体的背最长肌,置于液氮中运回实验室,保存于-80℃冰箱备用。

62个乌骨山羊血液样品和62个普通山羊血液样品分别采于通山乌羊育种有限公司羊场和重庆市畜牧科学院酉州乌羊保种场。用一次性无菌注射器采集山羊前腔静脉血液5 mL,分离血清置-20℃低温冰箱备用。

1.2 主要试剂 L-左旋多巴染色染料、核固红染料购于上海源叶生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(2 000 U)和胰蛋白酶购于武汉市普博欣生物科技有限公司,胰液素购于武汉百赛实验试剂;Soluene-350购置于美国PerkinElmer。

1.3 试验方法

1.3.1 肌肉组织切片多巴组化染色 采用多巴组织化学染色法对乌骨山羊和普通山羊的背最长肌切片进行染色分析观察黑色素颗粒的分布,具体方法参考文献［6］。

1.3.2 山羊肌肉组织中黑色素酶解法提取 采用酶解法从4个山羊肌肉样品中提取黑色素,具体方法参考文献［7］。根据羊肉特点作了改进,对每个肉样做3次重复。用木瓜蛋白酶、胰液素和胰蛋白酶对肉样进行处理,用Triton X-100、氯仿、石油醚、甲醇水溶液(水∶甲醇1∶1 v/v)和蒸馏水反复进行洗涤,得到黑色素颗粒。

1.3.3 山羊血清中黑色素指标的测定 分别测定62头乌骨山羊和62头普通山羊的124个血样的褐黑素、碱溶性黑色素和血浆颜色。具体方法参考文献［8］。

1.4 统计分析 将测得的山羊肌肉组织中黑色素含量数据和血清中黑色素含量的指标(褐黑素、碱溶性黑色素和血浆颜色)采用SAS 8.0统计软件,用t检验进行数据处理与分析,结果均以平均值±标准误表示。

2 结 果

2.1 乌骨山羊肌肉与组织切片 由图1可以看出,两者之间具有明显的颜色差异。乌骨山羊肌肉颜色呈乌黑色(图1-A),而普通山羊肌肉为鲜红色(图1-B)。

从多巴组织化学染色法得到的乌骨山羊肌肉组织切片中存在着大量黑色素颗粒,而且这些黑色素颗粒分布不规则(图1-C);但是普通山羊肌肉组织切片未见黑色素颗粒(图1-D)。

2.2 肌肉内黑色素含量 利用酶解法从山羊肌肉中提取黑色素的结果显示,乌骨山羊肌肉内黑色素含量为0.416%,普通山羊的黑色素含量为0.055%。乌骨山羊肌肉中的黑色素含量是普通山羊的7.6倍,两者差异极显著(＜0.01)。

2.3 血清中黑色素含量 由表1可以看出,乌骨山羊和普通山羊间血清中都有褐黑色素和碱溶性黑色素,但是褐黑色素、碱溶性黑色素以及血浆颜色在二者间均无显著差异(＞0.05)。

3 讨 论

3.1 肌肉组织中黑色素含量的分析 提取肌肉组织中黑色素的方法主要有酸解法和蛋白酶解法。相比于酸解法,酶解法提取得到的黑色素纯度更高,黑色素颗粒结构也不会被破坏,是现在主要的黑色素提取方法。酶解法测得乌骨山羊肌肉中的黑色素含量是普通山羊肉的7.6倍。这与之前文献中报道乌骨鸡和乌骨绵羊的肌肉组织中黑色素含量较高的结论一致［9-10］。可见,乌骨山羊“乌肉”的特征是由肌肉组织中含有大量黑色素而形成的乌质性状。

3.2 乌骨山羊肌肉组织中黑色素来源 在动物体内,黑素细胞主要分布于表皮和毛囊中。本实验室对乌骨山羊组织器官中的黑素细胞进行染色定位发现,乌骨山羊黑素细胞主要也是分布在表皮基底层、毛球部和毛球外根鞘,其他组织中未见黑素细胞的分布［11］,但是乌骨山羊黑色被毛的毛囊外根鞘部位的黑色素细胞呈活化状态,并且能够合成黑色素颗粒［6］;然而其他动物的毛囊外根鞘的黑色素细胞不分泌黑色素［12］。黑色素的排泄分为2个途径∶一种是大部分黑素细胞分泌黑色素颗粒转移到角质细胞中,随角质细胞的周期性脱落而发生运输［13］;二是部分黑素细胞将黑色素颗粒运输到到真皮层,经由输色素细胞吞噬,参与到血液循环［14］。由于乌骨山羊黑色被毛毛囊外根鞘部分黑素细胞的特殊性,推测乌骨山羊肌肉组织中的黑色素由黑色被毛毛囊外根鞘黑素细胞分泌然后通过血液运输到肌肉组织中。本研究发现,乌骨山羊和普通山羊血液血清中都含有黑色素,两者之间并无显著差异。这就存在这样的可能,黑色素由血液运输到山羊肌肉组织中,乌骨山羊黑色被毛毛囊外根鞘黑素细胞分泌的黑色素颗粒具有特殊性质,乌骨山羊对黑色素的降解速度比普通山羊的慢,或者乌骨山羊体内缺乏降解此类黑色素相关的酶,从而使黑色素在乌骨山羊体内沉积更多,当累积到一定时间和一定浓度后,则会出现乌骨山羊“乌肉”的性状。这可能是由于乌骨山羊降解黑色素的速度慢于普通山羊导致了黑色素在乌骨山羊肌肉组织内沉积,这也可以由本研究在乌骨山羊群体中观察到的年龄与乌质现象相关得到印证,即年龄越大的乌骨山羊,乌质性状越明显,乌骨绵羊群体内也存在这种现象,即随着年龄的增加,组织器官中的黑色素含量也随之增加,与从外貌观察的结果基本相同［15］。即乌骨山羊体内黑色素的沉积量是随着年龄的增加而逐渐增加的,具有明显的累积效应。为此,以后测定乌骨山羊与普通山羊黑色素降解有关酶的活性或基因效应,将有助于阐明乌骨山羊乌质性状形成的分子机理。

4 结 论

乌骨山羊肌肉组织中含有大量黑色素颗粒,这些黑色素颗粒可能是由黑色被毛毛囊外根鞘黑色素细胞分泌,经由血液运输到乌骨山羊肌肉组织中缓慢沉积,从而形成了乌骨山羊“乌肉”的特性。

致谢:感谢华中农业大学动物遗传与繁殖实验室提供的实验条件以及通山乌羊育种公司和重庆市畜牧科学院提供的实验材料。

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The Origin of Melanin in Muscular Tissue of Black-boned Goat

XU Fang-zheng1,JIANG Xun-ping1*,LIU Gui-qiong1,XIE Guang-yue1,ZHANG Teng-long,WANG Jian-guo2, WANG Run-shen3
(1.Institute of Animal Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Hubei Wuhan 430070,China; 2.Hubei Multi-lambs’Breeding Biological Technology Company,Hubei Wuhan 430070,China;3.Tongshan Blackboned Goat Breeding Company,Hubei Tongshan 437600,China)

It is a key point to know that the distribution and content of melanin in the black-boned goat’s muscle,it is also important to know where the melanin come from to understand why the black-boned goat has the black meat. Comparing with ordinary goat,making the longissimus doris section of black-boned goat and ordinary goat by DOPA straining;Extracting the melanin from the muscle of black-boned goat and ordinary goat by enzyme and calculating the melanin content;Measuring the melanin index (pheomelanin,alkali-soluble melanin and plasma color)by ultraviolet visible spectrophotometry in the serum.The results showed that there was a large number of melaningranules in the muscle of black-boned goat and none in ordinary goat’s muscle,the content of the melanin in blackboned goat was 0.416%,it was 7.6 times of that in the ordinary goat(P＜0.01);The content of the melanin index in goat’s serum was no significant difference between black-boned goat and ordinary goat(P＞0.05);Meanwhile there was no melanocyte in the black-boned goat’s muscle,so the melanin might be secreted by the melanocytes in the outer root sheath of the black hair follicles in black-boned goat and transported by blood,these melanin slowly deposited in the muscle,and then the color of black-boned goat’s muscle became black.

muscle tissue;melanocyte;melanin;black-boned goat

S827.2

A文献标识码:0258-7033(2015)11-0010-03

2014-11-17;

2014-12-29

国家肉羊产业技术体系(CARS39-1)

徐方正(1990-),男,硕士研究生,主要从事乌骨山羊乌质性状形成机理研究,E-mail:xnfangzhengsophia@qq.com

*通讯作者:姜勋平,男,教授,博士生导师,E-mail:xpjiang@mail. hzan.edn.cn