促红细胞生成素与早产儿脑白质损伤的关系研究

任 青，卢宪梅

(1.聊城市人民医院儿科，山东 聊城 252000；2.山东大学齐鲁医院儿科，山东 济南 250012)

促红细胞生成素与早产儿脑白质损伤的关系研究

任 青，卢宪梅

(1.聊城市人民医院儿科，山东 聊城 252000；2.山东大学齐鲁医院儿科，山东 济南 250012)

早产儿脑白质损伤(WMD)是神经系统伤残的主要原因之一。影像学是WMD的确诊依据。目前研究认为，促红细胞生成素(EPO)可促进早产儿脑发育并对脑损伤有保护作用。EPO脑保护的主要机制是抗凋亡、抗氧化、抗炎症、抗惊厥和促进脑血管新生等。同时，EPO基因又存在多态性，可能与早产儿WMD的个体易感性差异相关联。

早产儿；脑白质损伤；促红细胞生成素；基因多态性

随着围产医学的发展，早产儿成活率日益增加。报道显示10%左右的早产儿会发生脑性瘫痪，约25%～50%的早产儿会出现感觉、认知和行为发育障碍。这些神经系统伤残主要是脑白质损伤(white matter damage，WMD)所致[1-3]，严重影响儿童的健康成长和人口素质，早产儿脑性瘫痪(cerebral palsy，CP)占全都小儿CP病例的25～35%[4]。因此，探索早产儿WMD的发病机制，寻求有效的预防及治疗方法备受关注，而促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)作为一种新的神经保护因子，逐渐被人们所认识，成为近年研究的热点。

1 早产儿脑白质损伤的机制

1.1 早产儿脑白质损伤的病理与发病机理

WMD是早产儿脑损伤的主要形式，包括局灶型白质损伤、广泛型白质损伤、囊性脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia，PVL)，以及点状脑白质损伤和T2加权弥漫过高信号强度(DESHI)。WMD病理特点包括脑白质凝固性坏死、少突胶质细胞损伤、髓鞘损害、轴突损伤、星形细胞反应性胶质化和小胶质细胞浸润等[5]。目前认为早产儿WMD与早产儿脑发育不成熟、缺氧缺血和感染/炎症反应有关[6-7]。局灶性WMD与终末区长、短穿支动脉远端发育不成熟有关。弥漫型WMD则主要发生在个别长穿支动脉间的边缘区或短穿支动脉终末区。早产儿脑血管自主调节能力差，处于“压力被动性脑循环”状态，脑血流量增加和脑血流调节受损，均易引起脑损伤。少突胶质细胞(oligodendrocytes，OLs)前体包括先祖细胞(pre-progenitor cells，PP)、早期少突胶质祖细胞(early oligodendrocyte progenitor cells，early OPC)、晚期少突胶质祖细胞(1ate oligodendrocyte progenitor cells，late OPC)，OLs易损性为成熟依赖性，不同发育阶段的OLs对缺氧缺血的易损性不同，晚期OPC最为易损，但Pre-OLs成熟依赖的易损性机制还不甚清楚[8]。

OLs分化过程中，对凋亡和坏死都非常敏感。缺氧缺血和感染共同激活氧自由基攻击、兴奋性氨基酸毒性和细胞因子作用，导致OLs前体细胞死亡和凋亡，以及髓鞘发育分化障碍。氧自由基(oxygen free radical，OFR)主要攻击pre-OLs线粒体，激活凋亡诱导因子和半胱天冬酶-3(Caspase-3)，进而导致pre-OLs凋亡[9-10]。清除OFR可减轻WMD[11]。兴奋性谷氨酸毒性作用通过受体和非受体途径介导，缺氧缺血时，NMDA及AMPA/Kainate受体所控离子通道开放，大量Ca2+内流，加重突触后细胞内Ca2+超载，激活蛋白水解酶、磷脂酶和核酸内切酶，导致神经元变性坏死。近年发现多种免疫细胞和细胞因子参与了WMD的发生，宫内感染和缺血缺氧等刺激中枢神经系统巨噬细胞、内皮细胞、神经元、星形细胞和小胶质细胞，迅速表达高水平的肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、IL-1β、IL-10、IL-12和趋化因子等[12-14]，有研究认为IL-6≥1.077×10-7g/L是WMD发生的独立危险因素[15]。细胞因子增加血脑屏障的通透性，激活小胶质，并引发以小胶质为起始的级联反应。

1.2 早产儿脑白质损伤的影像学改变

影像学是脑白质病变的唯一确诊依据。头颅超声是诊断PVL最主要的手段。头颅MRI则能更可靠的探测到轻中度脑白质损伤，如微小弥漫白质损伤、点状病变和T2加权DEHSI[16]。MRI弥散加权成像(DWI)通过表观弥散系数(ADC)值定量评估水分子的弥散程度，从而评估脑损伤程度，国内外已应用于新生儿脑白质损伤的早期诊断和识别。弥散张量成像(diffuse tensor imaging，DTI)可显示出神经纤维的传导通路或神经纤维束的走向、绕行、交叉及中断、破坏等，是目前唯一可以无创观察和定量脑白质纤维束的检查方法。磁敏感加权成像(T2 Star weighted angiography，SWAN)序列是一个多回波、高分辨率的3D梯度回波序列，对出血性病变的显示极为敏感。因此，头颅MRI已经成为评估早产儿白质成熟和损害的一个有重要价值的工具[17]。

1.3 早产儿脑白质损伤的其他评价指标

髓鞘蛋白(MBP)反映OLs及髓鞘结构和功能。细胞因子IL-6是脑损伤的特异性标志物[18]。S100B蛋白主要分布于中枢神经系统和周围神经系统，早产儿WMD时S100B蛋白通过细胞间隙进入脑脊液和血液，其含量变化与临床症状、体征及影像学改变密切相关。神经元特异性烯醇化酶(neuron specificenolase，NSE)是糖酵解途径的关键酶，可作为评判早产儿WMD的重要指标，且与神经元的损伤呈正相关。脑型肌酸激酶同工酶(CPK-BB)主要存在于大脑、小脑及垂体的胶质细胞和神经元胞质中，早产儿WMD早期CPK-BB增高程度与预后有关。

2 促红细胞生成素对早产儿脑发育和脑损伤的保护作用

2.1 促红细胞生成素的来源

EPO是一种含唾液酸的酸性糖蛋白，主要来源于肾脏及胚胎肝脏，EPO存在于包括脑、心脏、血管和肾脏等非造血系统组织中，为内源性细胞因子激素。缺氧、缺血、某些代谢异常(如低血糖)等因素与其产生相关。缺氧诱导因子、胰岛素及胰岛素样生长因子、肿瘤坏死因子及γ-干扰素均可刺激某些脑细胞中EPO的产生。

2.2 促红细胞生成素对脑的作用

EPO通过激活其受体(EPOR)而实现功能，EPOR分为同二聚体和异二聚体，同二聚体主要分布于前体红细胞，异二聚体分布在神经元和神经胶质等细胞。在人类的脑组织中广泛分布着EPO和EPOR，EPOR表达于中枢神经系统发育过程中的许多细胞上，包括神经祖细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[19]。EPO及其受体的表达水平在早产儿脑发育和脑损伤中具有重要的作用和地位。在正常生理条件下EPO具有促使神经元增生、肥大、树突增多、功能增强和分化良好的神经发育作用。EPO通过调节与记忆相关的神经网络中细胞的可塑性和细胞间的连接来提高神经网络的功能。EPO可刺激轴突再生长、神经突起形成、神经树状结构的生长、神经电活性及调节神经细胞内钙离子浓度、神经递质的合成与释放等[20]。

EPO是一种重要的神经营养因子和神经保护因子，具有抗凋亡作用[21-22]，还有抗氧化、抗炎症和促进脑血管新生的作用[23-24]。经腹或皮下注射EPO能提高新生动物或新生儿的神经行为能力[25]。应用纳米级的EPO可治疗鼠脑室周围白质软化[26]。动物实验显示，EPO可使O4+/GFP+少突细胞前体、NeuN+/GFP+神经元显著增加，而GFAP+/GFP+星形胶质细胞则明显减少[27]。EPO在哺乳动物的神经保护和神经再生功能是通过Janus-酪氨酸激酶-2(Janus kinase-2，JAK-2)、转录激活子-5(signal transducer and activator of transcription-5，Stat5)和核转录因子-κB(nuclear transcription factor κB，NF-κB)的磷酸化，以及磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositol-3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)信号通路所介导[28]。通过激活JAK-2/Stat5通路而阻止神经元凋亡；通过磷酸化NF-κB、PI3K和AKT途径，促进抗氧化信号通路转导激活，发挥抗氧化作用；通过PI3K/AKT依赖机制阻止兴奋性神经毒性作用；通过PI3K/AKT和细胞外信号调节激酶信号转导通路刺激血管内皮生长因子的分泌和血管生成[29]；通过增加抗凋亡基因Bcl-2，Bcl-XL表达水平，抑制促凋亡基因Bax表达，调节凋亡/抗凋亡基因的平衡和抑制Caspase激活发挥抗凋亡作用；以及抑制炎症细胞因子，减轻炎症反应[30]，EPO可通过抑制炎症细胞浸润和神经脱髓鞘来促进神经功能的恢复。此外，EPO可促进神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的增殖和分化，还可显著促进缺血后损伤的神经元轴突延伸，促进神经修复和再生，并有抗惊厥作用[31-32]。因此，EPO通过多种信号途径发挥神经保护作用，是脑发育和脑损伤的重要细胞因子激素。临床和动物试验表明EPO具有抑制细胞凋亡、脑水肿、兴奋性神经毒性、炎症反应和氧化应激损伤等神经保护作用[24]。

3 促红细胞生成素基因存在多态性与早产儿脑白质损伤的易感性

3.1 促红细胞生成素基因存在多态性

研究发现EPO基因存在多态性。rs1617640位于EPO基因启动子区域(转录起始位点上游1 125bp)，人类EPO基因位于染色体7q21上，含有5个外显子和4个内含子，EPO由193个氨基酸序列合成，经过转化其活性蛋白为165个氨基酸多肽，随后发生高度糖基化，其分子量为18.4kD。其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)G/G基因型与EPO基因的转录活性及血清中EPO的水平有关。骨髓异常增生综合征患者EPO rs1617640基因型(G/G，G/T，T/T)的分布明显不同于对照组和白血病组[33]。糖尿病患者有3个EPO基因SNP(rs507392 CC基因型，rs1617640 GG基因型，rs551238 CC基因型)与视网膜病变相关[34]。EPO基因缺氧反应元件序列C3434T是缺氧诱导因子-1(HIF-1)与EPO结合位点，其多态性与高血压有关，CC基因型患者血压水平高于CT/TT基因型患者[35]。

3.2 早产儿脑白质损伤个体易感性

早产儿WMD虽然与脑组织发育不成熟、缺氧缺血和感染/炎症反应有关，但一些极低甚至超低出生体重儿、绒毛膜炎、窒息缺氧甚或机械通气的早产儿并未发生脑白质损伤。因此，早产儿WMD存在个体易感性差异。

3.3 以上二者可能相关联

有研究表明，EPO基因启动子区域rs1617640位点的单核苷酸多态性G/G基因型与EPO基因的转录活性及血清中EPO的水平有关，缺氧反应元件序列C3434T是HIF-1与EPO结合位点，因而这2个基因的多态性可能与脑组织EPO基因的转录活性及其蛋白水平有关，并影响其在神经发育和神经保护中的作用，导致早产儿WMD的发生和发展，与早产儿WMD的易损性和损伤后的转归存在一定的关联性。

4 展望

作为内源性细胞因子激素的EPO对早产儿脑发育和脑损伤具有非常重要的作用，可能提高远期神经预后。但EPO基因多态性与早产儿WMD的易感性有何关联？阐明EPO基因多态性在早产儿WMD发生中的作用，若能从基因角度揭示早产儿WMD的易感性机制，可能为进一步探讨合理应用外源性EPO防治早产儿WMD提供科学依据。

此外，由于客观条件、伦理等限制，应用外源性EPO预防或治疗早产儿WMD，相关的临床研究较少。是否由此可能干扰内源性EPO表达水平而扰乱正常的发育模式？其次EPO诱导NSCs增殖，可能对于多能干细胞具有反馈抑制作用，以及是否会干扰正常凋亡过程而影响新生脑发育？是否会有长期应用的不良反应，如红细胞增多、神经纤维退化、神经肌肉接头减少及多器官退化等，以及EPO的生血管作用是否与早产儿视网膜病变的发生相关，还有待进一步研究。

[1]Douglas-Escobar M, Weiss M D.Biomarkers of brain injury in the premature infant[J]. Front Neurol,2012,3:185.

[2]Panigrahy A, Wisnowski J L, Furtado A,etal.Neuroimaging biomarkers of preterm brain injury: toward developing the preterm connectome[J]. Pediatr Radiol,2012, 42 (Suppl 1):S33-S61.

[3]Jantzie L L, Miller R H, Robinson S.Erythropoietin signaling promotes oligodendrocyte development following prenatal systemic hypoxic-ischemic brain injury[J].Pediatr Res,2013,74(6):658-667.

[4]O’Callaghan M E, MacLennan A H, Gibson C S,etal. Epidemiologic associations with cerebral palsy[J].Obstet Gynecol,2011,118(3):576-582．

[5]Selip D B, Jantzie L L, Chang M,etal. Regional differences in susceptibility to hypoxic-ischemic injury in the preterm brain: exploring the spectrum from white matter loss to selective grey matter injury in a rat model[J].Neurol Res Int,2012，2012:725184.

[6]Liu X B, Shen Y, Plane J M,etal. Vulnerability of premyelinating oligodendrocytes to white-matter damage in neonatal brain injury[J].Neurosci Bull,2013,29(2):229-238.

[7]Brehmer F, Bendix I, Prager S,etal.Interaction of inflammation and hyperoxia in a rat model of neonatal white matter damage[J].PLoS One,2012,7(11):e49023.

[8]Volpe J J, Kinney H C, Jensen F E,etal. The developing oligoden-drocyte:key cellular target in brain injury in the premature infant[J].Int J Dev Neurosci,2011,29(4):423-440.

[9]Ten V S, Yao J, Rantner V,etal. Complement component c1q mediates mitochondria-driven oxidative stress in neonatal hypoxic- ischemic brain injury[J].J Neurosci,2012,30(6):2077-2087.

[10]Ten V S, Starkov A. Hypoxic-ischemic injury in the developing brain:the role of reactive oxygen species originating in mitochondria[J].Neurol Res Int,2012,2012:542976.

[11]Vottier G, Pham H,Pansiot J,etal. Delete- rious effect of hyperoxia at birth on white matter damage in the newborn rat[J].Dev Neurosci,2011,33(3-4):261-269.

[12]Zhao J, Chen Y R, Xu Y X,etal. Effect of intrauterine infection on brain development and injury[J].Int J Devel Neurosci,2013,31(7): 543-549.

[13]Moore C S, Abdullah S L, Brown A,etal. How factors secreted from astrocytes impact myelin repair[J].J Neurosci,2011,89(1):13-21.

[14]Burd I, Balakrishnan B, Kannan S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth[J].Am J Reprod Immunol,2012,67(4):287-294.

[15]Hassanein S M, El-Farraash R A, Hafez H M,etal. Cord blood interleukin-6 and neonatal morbidities among preterm infants with PCR-positive Urea- plasma urealyticum[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2012,25(10):2106-2110.

[16]Ciambra G, Arachi S, Protano C,etal. Accuracy of transcranial ultrasound in the detection of mild white matter lesions in newborns[J].J Neuroradiol, 2013,26(3):284-289.

[17]Pandit A S, Ball G, Edwards A D,etal.Diffusion magnetic resonance imaging in preterm brain injury[J].Neuroradiology,2013,55(Suppl 2):65-95.

[18]Giuseppe D, Sergio C, Pasqua B,etal. Perinatal asphyxia in preterm neonates leads to serum changes in protein S-100 and neuron specific enolase[J].Curr Neurovasc Res,2009,6(2):110-116.

[19]Chatagner A, Hüppi P S, Ha-Vinh Leuchter R,etal.Erythropoietin and neuropro tection[J].Arch Pediatr,2010,17(Suppl 3):S78-S84.

[20]Byts N, Siren A L.Erythropoietin:a multimodal neuroprotective agent[J].Exp Transl Stroke Med,2009, 1:4.

[21]Juul S E, Beyer R P, Bammler T K,etal. Microarray analysis of high-dose recombinant erythropoietin treatment of unilateral brain injury in neonatalmouse hippocampus[J].Pediatr Res,2009,65(5):485-492．

[22]Mengozzi M, Cerveilini I, Villa P,etal. Erythropoietin-induced changes in brain gene expression reveal induction of synapdc plasticity genes in experimental stroke[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(24):9617-9622.

[23]Alexander M L, Hill C A, Rosenkrantz T S,etal. Evaluation of the therapeutic benefit of delayed administration of erythropoietin following early hypoxic-ischemic injury in rodents[J].Dev NeurosciM,2012,34(6):515-524.

[24]Traudt C M, Juul S E. Erythropoietin as a neuroprotectant for neonatal brain injury:animal models[J].Methods Mol Biol,2013,982:113-126.

[25]Fan X, Kavelaars A, Heijnen C J,etal. Pharmacological neuroprotection after perinatal hypoxic-ischemic brain injury[J].Curr Neuropharmacol,2010,8(4):324-334.

[26]Wang T, Hu Y, Leach M K,etal. Erythropoietin-loaded oligochitosan nanoparticles for treatment of periventricular leukomalacia[J]. Int J Pharm,2012,422(1-2):462-471

[27]Gonzalez F F, Larpthaveesarp A, McQuillen P,etal. Erythropoietin increases neurogenesis and oligodendrogliosis of subventricular zone precursor cells after neonatal stroke[J].Stroke,2013,44(3):753-758.

[28]Miljus N, Heibeck S, Jarrar M,etal. Erythro-poietin-mediated protection of insect brain neurons involves JAK and STAT but not PI3K transduction pathways[J].Neuroscience,2014,258:218-227.

[29]McPherson R J, Juul S E.Erythropoietin for infants with hypoxic-ischemic encephalopathy [J].Curr Opin Pediatr,2010,22(2):139-145.

[30]Yu Z, Tang L, Chen L,etal. Erythropoietin reduces brain injury after intra- cerebral hemorrhagic stroke in rats[J].Mol Med Rep,2013,8(5):1315-1322.

[31]Bjorkman S T, Miller S M, Rose S E,etal. Seizures are associated with brain injury severity in a neonatal model of hypoxia-ischemia[J].Neuroscience,2010,166(1):157-167．

[32]Elmahdy H, El-Mashad A R, El-Bahrawy H,etal. Human recombinant erythropoietin in asphyxia neonatorum: pilot trial[J].Pediatrics,2010,125(5):e1135-e1142.

[33]Ma W, Kantarjian H, Zhang K,etal. Significant association between polymorphism of the erythropoietin gene promoter and myelodysplastic syndrome[J].BMC Med Genet,2010, 11:163.

[34]Abhary S, Burdon K P, Casson R J,etal. Association Between Erythropoietin Gene Polymorphisms and Diabetic Retinopathy [J].Arch Ophthalmol,2010,128(1):102-106.

[35]Schulz E G, Neumann C L, Menne J,etal. An erythropoietin gene polymorphism in the hypoxia-responsive element at position 3434 is possibly associated with hypertension[J].Kidney Blood Press Res,2012,35(2):71-76.

[专业责任编辑：刘黎明]

Relationship between erythropoietin and white matter damage of premature infants

REN Qing1, LU Xian-mei2

(1.DepartmentofPediatrics,LiaochengPeople’sHospital,ShandongLiaocheng252000,China;2.DepartmetnofPediatrics,QiluHospitalofShandongUniversity,ShandongJinan250012,China)

White matter damage (WMD) of premature infants is one of the significant causes leading to neurological disabilities, and imaging is the way to identify the disease. Up to now, researches have found that erythropoietin (EPO) could not only improve brain development, but have protective effect on preterm neonatal brain injury. The fundamental mechanism of EPO is its ability of inhibiting apoptosis, anti-oxidation, anti-inflammatory, anti-epilepsy, and angiogenesis. Meanwhile, there are gene polymorphisms in EPO gene, which maybe relate with the individual susceptibility difference in WMD of premature infants.

premature infants; white matter damage (WMD); erythropoietin (EPO); gene polymorphisms

2015-01-23

国家自然科学基金资助项目(11471152)

任 青(1972-)，女，副主任医师，硕士，主要从事新生儿疾病的诊疗工作。

卢宪梅，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.086

R725

A

1673-5293(2015)04-0893-03