Notch信号通路及其在卵巢癌细胞中的作用

熊爱为，谢静燕

(南京医科大学附属南京医院 南京市第一医院妇科，江苏 南京 210006)

【妇幼综合研究】

Notch信号通路及其在卵巢癌细胞中的作用

熊爱为，谢静燕

(南京医科大学附属南京医院 南京市第一医院妇科，江苏 南京 210006)

Notch是一条进化上高度保守的跨膜受体家族，通过对Notch信号通路下游胞内活性成分(NICD)的激活来促进卵巢癌细胞的增殖和分化，影响细胞耐药特性。Notch通过与不同配体结合，在不同细胞环境中发挥不同作用，提示其通路活化的多样性。该文主要对Notch信号通路通过不同配体结合激活NICD而发挥不同的作用进行综述。

Notch信号通路；卵巢癌；增殖；分化

卵巢癌是严重威胁女性健康的疾病，病死率位于妇科肿瘤首位。卵巢癌有70%发现时已处于晚期，且Ⅲ期或Ⅳ期的5年生存率仍维持在20%～40%之间。目前对卵巢癌的经典治疗方案仍为手术加术后化疗，而以铂类与紫杉醇为基础的化疗方案术后复发率高是导致卵巢癌患者5年生存率低的重要原因。据研究，19%的早期卵巢癌及60%～85%的晚期卵巢癌会复发。近来发现，Notch在卵巢恶性细胞中异常表达，Notch信号通路下游分子参与到了卵巢癌细胞对铂类或者紫杉醇类化疗药物耐药、卵巢癌细胞增殖及凋亡等过程[1-3]，提示其与卵巢癌的发生发展可能相关。

Notch是一个高度保守的跨膜受体家族，广泛存在于无脊椎和脊椎动物体内。1917年Morgan在果蝇体内发现Notch基因，因其突变可致果蝇残翅(Notch ES)得名。近年来研究表明Notch通路广泛存在于卵巢癌、胰腺癌、直肠癌等恶性肿瘤组织细胞中[4]，当Notch通路发生障碍，会发生遗传性多发梗死综合征、自身免疫性疾病、T细胞白血病等。有研究证实Notch通路在卵巢癌细胞增殖等方面发挥重要作用[5]。

1 Notch信号通路及其经典激活方式

哺乳动物有4个同源Notch受体Notch 1～4和5个配体Dll1、Dll3、Dll4、Serrate样配体Jagged-1和Jagged-2。一般认为，Notch信号转导通路是进化上高度保守的一条通路，Notch受体通过与临近细胞的结合发挥作用。Notch跨膜蛋白一般包括富含表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)样重复区域的胞外区、跨膜区、可作用于转录激活因子(CRT-binding factor 1，CBF-1)的胞内区。经典的Notch通路亦称转录激活因子/Notch信号通路转录调控蛋白(recombination signal binding protein J kappa，RBP-Jk)依赖途径。Notch先是以异二聚体的形式与临近的配体Dll1、Dll3、Dll4及Jagged-1和Jagged-2相结合，随后被金属蛋白酶家族及解聚素剪切释放于胞外，一旦被释放，Notch蛋白的胞外区域被细胞以胞饮的形式内吞，随即以此为起点的下级偶联发挥作用，在γ-分泌酶的剪切下，下游Notch胞内活性成分(Notch intracellular domain，NICD)形成，并刺激下游CBF-1的高表达，继而形成CBF-1/RBP-Jk抑制因子复合物，特异性与DNA序列“GGTGGGAA”相结合，通过招募辅抑因子维甲酸/甲状腺受体沉默因子(silencing mediator of retinoid acid and thyroid hormone receptor，SMRT)、Ⅰ/Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶等蛋白形成共抑制复合物，抑制下游基因转录，如影响细胞周期蛋白cyclin D1、c-myc等的表达，进而影响细胞增殖、分化[6-7]，见图1。

2 Notch信号通路在卵巢癌细胞中的异常表达

WANG等[1]研究发现，Notch1、Notch3受体及其配体Dll4与Jagged-1在卵巢癌组织中表达明显高于正常组织，且发现Dll4在卵巢癌组织中表达相比于交界性及正常组织具有高度差异和独立性，且认为其与微血管密度(microvessel density，MVB)相关。Jung等[2]研究发现，相比于卵巢良性增生性病变，Notch3受体在卵巢浆液腺及透明细胞癌中表达显著升高，差别具有统计学意义；而其配体Jagged-1及Jagged-2升高不明显，无统计学差异。Rahman等[8]用免疫组化分析了111例卵巢癌组织中Notch3的表达情况，发现61例(55%)在胞核或胞浆中阳性表达，而正常卵巢组织中无Notch3的表达；进一步研究发现，与正常卵巢细胞相比，卵巢癌细胞中Notch3基因的扩增现象定位于染色体19p13.12，提示其与肿瘤发生可能相关，荧光定量PCR及荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization，FISH)水平均证实Notch3基因DNA及mRNA转录水平的扩增与Notch3在卵巢癌细胞19号染色体上的扩增具有显著相关性[3]。

注：邻近细胞配体结合到相邻细胞Notch跨膜蛋白的膜外区域，通过两次蛋白水解形成Notch细胞内活性区域(NICD)，NICD定位于细胞核后通过与CBF1结合来调节不同基因，包括HES-1、核转录因子κB(nuclear factor κappa B，NF-κB)等。

图1 Notch信号通路

Fig.1 Notch signaling pathway

3 Notch信号通路在卵巢癌细胞中的作用

3.1 Notch1受体及Notch2受体

3.1.1 Notch1受体单独刺激下游转录因子进而影响细胞增殖

在Notch1高表达的细胞中常发现HES-1(hairy enhancer of split 1)或其他下游因子的高表达，如前列腺恶性细胞疾病、神经内分泌肿瘤及卵巢癌细胞，但不能说明Notch1能直接刺激转录因子HES-1进而影响细胞增殖、分化。Notch2或者音猬因子(sonic hedgehog，SHH)也可通过HES-1发挥作用，当Notch1活性区域NICDI稳定转染A2780细胞后，A2780细胞株的48小时细胞活力高于对照组127%、72小时的活力高于对照组72%[9]，提示Notch1可单独刺激下游HES-1信号通路来刺激细胞活力[10]。Drenzek等[11]用黄腐酚抑制Notch1信号同路上CBF-1与下游转录基因的结合，荧光素酶报告基因验证抑制效果后，蛋白质印记法(western bolt，WB)结果提示p21WAF1/CIP1在黄腐酚干扰后的SKOV3及OVCAR3显著升高，并表现出一定的剂量依赖性；进一步探索发现干扰后的SKOV3及OVCAR3细胞S期及G2/M期细胞比例明显增加，磷酸化周期素依赖激酶2(phospho-cdc2 Tyr15，CDC2)检测确认了黄腐酚干扰后卵巢癌细胞通过捕获S期及G2/M期细胞抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。

3.1.2 Notch1胞内活性区域的促细胞增殖作用

Notch1胞外区在卵巢恶性肿瘤细胞及正常细胞中表达无明显差异，而胞内活性区NICD的表达具有明显差异。Rose等[12]的研究表明，NICD在卵巢癌细胞OVCAR3、SKOV3、CAOV3中均相较于对照组高表达，且发现在乳头状腺癌的患者中，NICD表达的比例占76%；NICD的表达还与卵巢癌的临床分期相关，NICD表达随着卵巢癌临床分期的严重而呈上升趋势；当干扰RNA沉默NICD后，细胞增殖实验(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)证实NICD在促进卵巢癌细胞的增殖中发挥了重要作用。Groeneweg等[13]进一步研究发现，随着Notch家族配体(Delta、Serrate、Lag3、DSL-family)与Notch受体的结合，在肿瘤坏死因子α转化酶(tumor necrosis factor-a-converting enzyme，TACE)作用下，卵巢腺癌细胞胞内NICD通过与Notch信号通路转录辅助激活蛋白(mastermind-like factors，MAML)及转录辅酶A(transcriptional coactivators，CoA)结合形成下游转录复合物，进而依靠HES与断裂基因4转导蛋白样增强子(transducin-like enhancer of split，TSL)的协同作用促进细胞增殖。

3.1.3 Notch1受体具有部分抑癌基因作用

Notch1及Notch2主要存在于细胞质中，免疫组化染色结果表明Notch1在细胞中的异位情况随着细胞恶性程度的增高而呈下降趋势，Notch1在浆液性囊腺瘤及黏液性囊腺瘤中阳性率分别为50%和33.3%，其中13%及33.3%为明显胞内异位(+++)，而交界性肿瘤的阳性率则为20%；Notch2在卵巢恶性肿瘤、交界性、良性组织中阳性率分别为97%、100%、83%[14]。由此可见，Notch1可能具有某些抑癌基因的作用，而Notch2在卵巢恶性细胞、交界性、良性细胞中均高表达，3种细胞之间表达差异无统计学意义，提示Notch2在卵巢癌细胞的增殖中可能存在作用而与卵巢癌的发生机制无明显关系。

3.1.4 Notch1受体信号通路对卵巢癌细胞耐药性及细胞凋亡的作用

WANG等[15]研究发现，用间接抑制Notch活性的γ-分泌酶抑制剂{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT}抑制Notch信号通路后，可通过调节下游细胞周期因子cyclin B1、Bcl-2及Caspase-3，捕捉处于G2期的卵巢癌细胞来降低细胞耐药性，并促进卵巢癌细胞凋亡。该研究还发现，联合使用DAPT及顺铂处理卵巢癌耐药细胞可得到不同结果：DAPT处理后再予顺铂处理，卵巢癌耐药细胞可使二者拮抗卵巢癌细胞的作用增强，而顺序相反则无明显抗卵巢癌耐药细胞作用，与此同时，Groeneweg等[13]发现，用γ分泌酶抑制剂(gamma-secretase inhibitor，GSI)处理卵巢癌细胞后，可提高2/3卵巢癌细胞对铂类药物敏感性(P<0.05)，且GSI联合紫杉醇可使卵巢癌细胞对化疗药物敏感性大于二者单独使用，有趣的是，使用GSI后似乎并不影响传统环磷酰胺联合顺铂化疗方案疗效[13，15-16]。

3.2 Notch3受体

3.2.1 Notch3可以通过非核转录因子通路调节细胞增殖

Jagged-1配体是卵巢癌细胞中最常见的配体，研究表明其通过调节血管形成调节肿瘤进展及微环境，对Jagged-1配体沉默后发现细胞的黏附和生长能力有显著降低[16]。Park等[17]研究表明，Jagged-1的激活有赖于Notch3通路的激活，Notch3胞内活性片段上调后可激活Jagged-1，而单向敲除Jagged-1后，对Notch3的影响不明显，由此表明，Notch3不但通过经典NF-κB通路调节细胞增殖分化，还可激活Jagged-1配体活化细胞。

3.2.2 Notch3及其下游胞内活性区域对卵巢癌细胞分化及转移中的作用

Rahman等[8]发现Notch3阳性卵巢癌细胞用RNA干扰后，细胞增殖活力明显低于Notch3阴性细胞，提示Notch3对于卵巢癌细胞具有增殖促进作用。Jung等[2]研究结果提示，Notch3在卵巢癌细胞及卵巢正常细胞中阳性率分别为78%(45/58)、24%(5/21)，差别具有统计学意义，而Notch3下游活性因子NICD在所有卵巢细胞中均有表达，卵巢恶性细胞与正常细胞表达水平分别为1.64±0.19(/103)、0.98±0.2(/103)，差别有统计学意义(t=4.216，P<0.05)；卵巢癌细胞中低分化与中高分化、Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌组织中NICD的表达具有明显差异，而卵巢癌的病理类型、手术-病理分期以及是否行放化疗与NICD的表达无关[2，6]，提示Notch3对卵巢癌细胞的增殖特别是分化及转移具有明显促进作用。

3.3 Notch4受体

目前对Notch4受体通路在卵巢癌细胞中作用的研究较少，仅有研究表明其可能与卵巢癌细胞增殖[6]有关，并有可能作为卵巢癌干细胞潜在表面分子标志[18]。

4 讨论

Notch1及Notch2对卵巢癌细胞具有明显促进增殖作用，而Notch1具有某些抑癌基因作用，同时Notch1及Notch2对于卵巢癌细胞发生机制无明显相关性；Notch3可通过非经典NF-κB途径调节卵巢癌细胞增殖、分化，对卵巢癌细胞分化及临床转移具有明显促进作用。

顺铂和卡铂类药物通过损伤DNA复制、转录最终导致细胞凋亡，Notch信号通路抑制剂GSI抑制Notch下游因子后，组蛋白γ-H2AX中心点的氧化磷酸化反应揭示抑制后DNA损伤作用[19]，猜想GSI可增加耐药细胞株对于铂类药物的敏感性，其机制可能与增加DNA损伤作用、捕获处于G2/M期卵巢癌细胞、促进细胞凋亡有关，提示GSI可能作为克服铂类化疗药耐药问题的有效途径。

有趣的是，在Notch受体信号通路激活方面，有研究者发现用GSI抑制Notch通路后，细胞增殖抑制作用无明显变化[20]，可能存在两种可能，①Notch下游通路激活非经典Notch通路依赖性；②Notch受体可能存在持续性激活特点导致GSI作用后无明显变化。同时发现，当miR-128、miR-215/625或miR-502-5p等低表达与PPARG、RUNX1和CCND1基因高表达后，卵巢癌患者的生存率明显下降，提示某些基因表型修饰后有可能通过miRNA结合mRNA3'端非翻译区，进而结合下游细胞因子转录水平启动子区域激活Notch通路[21]，而当用FSH刺激细胞后，Notch通路的激活提示Notch通路活化的多样性[22]，这都提示Notch通路激活具体机制及调控细胞周期机制需进一步研究。

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[专业责任编辑：安瑞芳]

Notch signaling pathway and its role in ovarian cancer cells

XIONG Ai-wei, XIE Jing-yan

(DepartmentofGynaecology,NanjingFirstHospital,NanjingMedicalUniversity,JiangsuNanjing210006,China)

Notch is a evolutionarily conserved transmembrane receptor family, which accelerates the proliferation and differentiation of ovarian cancer cells by activating Notch intracellular domain (NICD) at lower part of Notch signaling pathway and thus affects drug resistance characteristics. Combined with different ligand binding, Notch plays different roles in different cellular environment, which indicates the variety of pathway activation. This review focused on the effect of Notch signaling pathway to activate NICD by combining different ligand binding.

Notch signaling pathway；ovarian cancer；proliferation；differentiation

2015-02-01

国家自然科学基金资助项目(No.81572557)

熊爱为(1989-)，男，在读硕士研究生，主要从事妇科恶性肿瘤的研究。

谢静燕，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.071

R737.31

A

1673-5293(2015)05-1100-03