TNF-α在小儿结肠息肉中的表达及临床意义
2015-01-24任晓侠杨洪彬
任晓侠,方 莹,杨洪彬
(西安市儿童医院,陕西 西安 710003)
TNF-α在小儿结肠息肉中的表达及临床意义
任晓侠,方 莹,杨洪彬
(西安市儿童医院,陕西 西安 710003)
目的 探讨内源性肿瘤坏死因子α(TNF-α)在小儿结肠息肉中的表达及临床意义。方法 采集45例结肠息肉患儿(实验组)及36例正常结肠粘膜儿童(对照组)的血清,运用夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测TNF-α在两组血清中的表达;免疫组化法检测TNF-α在两组患儿结肠组织中的表达,分析TNF-α的表达与结肠息肉的关系。结果 TNF-α在实验组血清中的表达高于对照组(t=5.360,P<0.05),在实验组结肠组织中表达高于对照组(χ2=10.434,P<0.05);在实验组中,腺瘤性息肉中TNF-α的表达较幼年性息肉中无明显差异(P>0.05)。结论 TNF-α在结肠息肉组织中的高表达,提示TNF-α在儿童结肠息肉的发生发展中可能起重要作用,有可能成为判断结肠息肉预后复发的标志物。
肿瘤坏死因子α;儿童;结肠息肉;病理诊断;夹心法酶联免疫吸附试验法;免疫组化
结肠息肉是儿童消化系统常见疾病。大多数为单发、且为良性病变,病理分为幼年性、腺瘤性、炎症性和增生性等四种,其中90%为幼年性息肉,常见于2~10岁的儿童,由炎症引发的几率较大。在患病儿童中,一般以6岁左右较为常见[1]。结肠息肉最常见的症状为间歇性无痛性便血,占80%~100%,随着全结肠镜检查技术的普及应用,结肠息肉的检出率逐渐升高。结肠息肉也是儿童最常见良性肿瘤之一[2]。患儿若得不到有效治疗,免疫力会显著降低,同时并发因慢性失血所致的缺铁性贫血和营养不良等症状,长期以往会影响患儿生长发育,甚至可引起肠套叠等外科急腹症。但结肠息肉的病因及发病机制至今仍不清楚[3],其中结肠粘膜长期的炎症刺激是公认的病因之一。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是机体内的一种生物活性因子,由肺泡巨噬细胞产生,活性强,在机体炎症反应中发挥重要作用。本研究通过测定TNF-α在结肠息肉患儿血清及组织中的表达水平,探讨其在小儿结肠息肉发病机制中的作用及临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集西安市儿童医院2010年5月至2012年12月在消化科行结肠镜检查的221例有消化道症状的患儿。从中筛选出45例确诊为结肠息肉的患儿纳入研究(实验组),其中男28例,女17例,年龄3~12岁。男女比例1.64:1,平均年龄6.24±2.8岁,年龄10岁以上8例。其中因反复无痛性便血就诊而行结肠镜检查确诊息肉的有42例,便血病程1~12月,平均病程6.4±3.1个月,多表现为间断出现的成形大便表面带鲜血或者便后滴鲜血;另有3例以肠套叠收住普外科,入院后行空气灌肠后肠套叠复位成功,出院后短时间再次肠套叠,再次空气灌肠灌通后行结肠镜检查,镜下诊断结肠息肉,3例患儿息肉位置均较深,于右半结肠处,长粗蒂,直径均在2.5~3cm之间;45例患儿结肠息肉直径大小在0.8cm~3.0cm之间。无蒂息肉16例,亚蒂息肉20例,粗蒂9例。单发结肠息肉37例,2个或2个以上结肠息肉8例。45例结肠息肉患儿均行电子结肠镜下电凝切除术。术后随访仅1例复发者,为结肠多发息肉患儿。将结肠镜检查为正常结直肠粘膜的儿童36例纳入对照组(排除合并炎症性肠病等其他疾病,且资料不完整者)。两组患儿性别、年龄等一般资料比较,差异均无统计学意义(均P>0.05),具有可比性,两组患者及家长知情,行结肠镜检查前均签署了知情同意书。
1.2 诊断标准
采用Olympus Q260AI电子结肠镜行全结肠检查,发现息肉,根据其大小、数量及蒂的长短,静脉复合麻醉下经ERBE电刀高频电凝电切摘除结肠息肉治疗,根据其息肉的病理进行诊断。
1.3 纳入与排除标准
入组患者符合小儿结肠息肉的诊断标准,年龄3~12岁之间,临床资料完整,能够较好的配合实验。排除有肠道肿瘤、先天肠管畸形患者,排除心、肾功能不全患者,排除哭闹较严重、不能配合实验患者。
1.4 方法
1.4.1 血清及病理组织的采集
两组患儿入院后,采集空腹清晨血,存血容器需保证无热原且无内毒素,全程不干扰细胞活性。采血完毕后,以3 000r/min进行离心处理,持续10min,分离血清和红细胞。
实验组患者结肠息肉予以结肠镜电凝切除处理,将结肠息肉标本于10%福尔马林液中储存并石蜡包埋。对照组患儿在进行结肠镜检查后,乙状结肠至直肠位置取活检于10%福尔马林液中储存并石蜡包埋,备用。
1.4.2 肿瘤坏死因子α的测定
1.4.2.1 运用夹心法酶联免疫吸附试验方法检测肿瘤坏死因子α在血清中的表达 进行双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA),在TNF-α抗体内,分别添加标本、标准品和辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体,用于检测,温育处理后清洗干净,并选取四甲基联苯胺(TMB)进行显色,显色过程中,由于有过氧化物酶的参与,由蓝色转换为黄色。实验中颜色与TNF-α有直接关联。波长控制在450nm内,选取酶标仪吸光度(OD值)进行检测,得出样品浓度。绘制Excel工作表,横坐标为标准品浓度,纵坐标为其OD值,在曲线图像中,按曲线方程计算各样本浓度值。
1.4.2.2 免疫组织化学染色方法检测组织中肿瘤坏死因子α的表达浓度 选择美国ZYMED公司SP系列:抗人TNF-αbs-0078R为一抗,二抗为山羊抗兔IgG SP-0023,具体步骤:石蜡切片,常规脱蜡至水。蒸馏水冲洗,磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5min;3%H2O2去离子水孵育15min,以消除内源性过氧化物酶活性;滴加适当比例稀释的一抗,370C孵育2~3h或40℃过夜,PBS冲洗,3min×3次,滴加二抗工作液,370C孵育10~15min;PBS冲洗,3min×3次;加入辣根酶对链酶卵白素工作液进行标记处理并赋予15min,保持环境温度以37℃为宜;PBS冲洗,3min×3次;显色剂显色,自来水冲洗,复染、脱水、透明,最后进行封片。对照试验:阴性对照选取PBS。
结果判断:TNF-α阳性细胞:主要为胞浆着色,呈浅黄色、细颗粒状,阴性对照均无阳性着色。
1.5 统计学方法
2 结果
2.1 病理类型分布
45例息肉患儿经电子结肠镜下行电凝切除术,切下息肉标本通过病理诊断发现,其中41例为幼年性息肉,4例为腺瘤性息肉。幼年性息肉病理特点:息肉为扩张的充满黏液的弯曲的囊腺和在突起的固有层中的炎性细胞,腺体含有分化良好的黏液细胞,间质明显增宽,内有丰富的结缔组织,其中含大量的血管和炎性细胞。腺瘤性息肉病理特点:肿物由增生的腺体和纤维组织构成,局部腺体排列密集,见图1。
a.正常结肠粘膜(10×20) b.腺瘤性息肉(10×20) c.幼年性息肉(10×20)
a. Normal colonic mucosa(10×20) b. Adenomatous polyp(10×20) c. Juvenile polyp(10×20)
图1 两组结肠粘膜的病理结果
Fig.1 Pathological results of colon mucosa of two groups
2.2 两组患者血清中肿瘤坏死因子α水平的比较
ELISA法显示:与正常粘膜组比较,实验组患者血清中TNF-α水平较高,差异具有统计学意义(P<0.05),见表1。
2.3 肿瘤坏死因子α在两组结肠组织中的表达
应用免疫组织化学分析TNF-α在对照组及实验组中的表达,表达过程多由细胞浆参与。如图2所示,对照组的样本中,TNF-α染色的组织部分较少,且呈浅黄色,说明对照组TNF-α表达较低。而实验样本的结肠息肉组织中,可观察到较多的浅黄色组织颗粒,说明TNF-α在实验组织中表达较高,P<0.05,有统计学意义。其中在实验组中腺瘤性息肉TNF-α的表达较幼年性息肉无明显差异,P>0.05,见表2。
a.正常结肠粘膜(10×20) b.腺瘤性息肉(10×20) c.幼年性息肉(10×20)
a. Normal colonic mucosa(10×20) b. Adenomatous polyp(10×20) c. Juvenile polyp(10×20)
图2 两组结肠组织中TNF-α的表达
Fig.2 Expression of TNF-α in colonic tissue of two groups
表2 两组患者TNF-α阳性率比较[n(%)]
Table 2 Comparison of TNF-α positive rate between two groups[n(%)]
2.4 在结肠组织中肿瘤坏死因子α的表达与临床病理特征
在45例结肠息肉患儿的实验组织中,TNF-α的表达阳性率与患儿性别、年龄、息肉部位、息肉大小、病理类型均无明显关系(均P>0.05),但其在多发实验组中的表达阳性率高于单发实验组中的阳性率,但差异无统计学意义(P>0.05),见表3。其中1例复发患儿为多发结肠息肉,其粘膜组织中TNF-α的表达为阳性,因复发组样本数目较少,故无法进行统计学分析。
表3 结肠息肉组织中TNF-α的表达与临床病理特征[n(%)]
Table 3 TNF-α expression and clinicopathological features in colonic polyps[n(%)]
3 讨论
3.1 肿瘤坏死因子α在肿瘤组织及炎症性疾病中的作用
TNF-α是一种由单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞产生的细胞因子,是重要的促炎因子和免疫调节因子,在肿瘤组织及炎症性疾病均发挥重要作用。在肿瘤恶变过程中,机体的巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T细胞等的浸润情况较为明显。在炎症发生的最初,机体会产生TNF-α,与机体血管与组织的修复以及肿瘤的生长等方面均有密切联系。研究证实,予以小鼠TNF-α拮抗剂,观察其结肠腺瘤性息肉与结肠癌的转换情况,发现转化的数量明显减少[4]。TNF-α可以激活机体的激活剂蛋白-1(AP-1)和转录因子NF-KB途径,并以该两种方式使细胞加速繁殖,使肿瘤病情加快发展。实验证实,肝癌动物模型在MdrZ缺失的情况下,TNF-α可以通过激活NF-KB的方式影响病情[5],肠道肿瘤方面,作用方式尚不清楚。在对结肠癌的动物进行探究时发现,与上皮细胞相比,TNF-α受体在造血细胞的表达更强[6]。儿童结肠息肉大部分为良性病变,但仍存在恶变潜能。多发性息肉如幼年性息肉病则有癌变倾向,腺瘤性息肉与癌关系密切,其癌变发生率随着瘤体的增大而增高;病理发现,有些患儿症状表现为幼年性息肉与腺瘤性息肉共同特征,恶化几率明显增加[7]。其他如家族性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)及Peutz-Jeghers综合征(PJS)也属癌前病变。本研究中免疫组织化学分析TNF-α在正常粘膜组结肠粘膜及实验组结肠息肉中的表达,TNF-α在以上组织中以细胞浆表达为主。在正常粘膜组织中,TNF-α染色后黄色颗粒组织面积较小,证明TNF-α在正常组粘膜组织中的表达较弱,而在结肠息肉组织,可观察到大量的浅黄色颗粒,证明实验组织中TNF-α表达较强,尤其在靠近血管的组织附近,表达明显增强。
3.2 肿瘤坏死因子α儿童结肠息肉组织中的表达
目前,儿童结肠息肉的病理类型大多为幼年性息肉,但其病因尚不清楚,其中,炎性起源学说认为是由于肠粘膜对局部刺激的应答而产生,认为幼年性息肉的形成可能与粪石对黏膜的慢性损伤有关,唾黏蛋白和硫酸黏蛋白在幼年性息肉与炎性息肉中有相同分布;同时在幼年性息肉中观察到上皮细胞的再生改变以及突出的间质反应,包括水肿、炎性细胞浸润、轻度纤维化和腺体囊性改变[8]。本研究发现,免疫组化显示在实验组中的TNF-α表达明显高于正常粘膜组,而在实验组中腺瘤性息肉TNF-α的表达较幼年性息肉无明显差异,提示TNF-α作为一种炎症因子可能在息肉或腺瘤的发生发展中起了非常重要的作用;另外,本研究发现在多发实验组中的表达阳性率高于单发实验组中的阳性率,但差异无统计学意义,不除外与多发实验组样本量太小有关;在随访观察中,其中1例复发患儿为多发结肠息肉,其粘膜组织中TNF-α的表达为阳性,提示TNF-α可能在息肉的复发中亦发挥作用,但因复发样本小,无法行统计学分析,仍需长期随访证实。
综上所述,TNF-α作为炎症的一个重要细胞因子,它是炎症反应的发起者。TNF-α在儿童息肉的发生发展中可能起到一定的作用,为今后研究小儿结肠息肉发病机制提供一定的参考意义。在结肠息肉患儿中,有3%的恶化几率,因此,在医院接诊患儿时,应予以全方面的肠道检查,一旦观察到有息肉的出现,应立即予以切除,从而控制患儿病情。针对年龄大于10岁的患儿,应做到完全切除,不留恶化的隐患,并在治疗后进行定期病情随访。对于儿童长期的腹泻及便秘,应及时纠正,预防息肉的发生。
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[专业责任编辑:王宝西]
Expression and clinical significance of TNF-α in children with colon polyps
REN Xiao-xia, FANG Ying, YANG Hong-bin
(Xi’anChildren’sHospital,ShaanxiXi’an710003,China)
Objective To investigate the expression and clinical significance of endogenous tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in children with colonic polyps. Methods Serum of 45 cases (experimental group) with colonic polyps and 36 cases (control group) with normal colonic mucosa was detected with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to explore the expression of TNF-α. Immunohistochemical method was used to detect the expression of TNF-α in colonic tissue. The relationship between expression of TNF-α and colonic polyps was analyzed. Results The expression of TNF-α in serum was higher in the experimental group than in the control group (t=5.360,P<0.05), so was in colonic tissue (χ2=10.434,P<0.05). In the experimental group the expression of TNF-α was not significantly different between adenomatous polyp and juvenile polyp (P>0.05). Conclusion High expression of TNF-α in colon polyps suggests that TNF-α may play an important role in the development and progression of colon polyps in children. It may be a marker for judging the prognosis of colon polyps.
tumor necrosis factor alpha (TNF-α); children; colon polyps; pathological diagnosis; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); immunohistochemistry
2015-07-14
任晓侠(1977-),女,主治医师,硕士研究生,主要从事儿童消化道疾病的内镜下诊断及治疗。
方 莹,副主任医师。
10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.022
R725.7
A
1673-5293(2015)05-0973-04