shRNA表达载体沉默BHRF1对鼻咽癌CNE2细胞生长、凋亡及细胞周期的影响

张艳平 丁 矢* 李雪兰 杨 杰 唐 峰 欧 勇

（常德职业技术学院医学系，湖南 常德 415100）

shRNA表达载体沉默BHRF1对鼻咽癌CNE2细胞生长、凋亡及细胞周期的影响

张艳平 丁 矢* 李雪兰 杨 杰 唐 峰 欧 勇

（常德职业技术学院医学系，湖南 常德 415100）

目的探讨沉默shRNA对鼻咽癌CNE2细胞生长、凋亡及细胞周期的影响。方法构建负载BHRF1 shRNA的慢病毒载体并转染至CNE2细胞，采用MTT法观察转染24、48、72及96 h的增殖抑制率，采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测转染48 h的细胞凋亡率及细胞周期。结果BHRF1 shRNA可增加CNE2细胞增殖抑制率，96 h时达最大，各时间点的差异有统计学差异（P＜0.05）；转染48 h后的凋亡率增加，G1/G0期细胞比例均高于对照组，S、G2/M期细胞比例低于对照组（P＜0.05）。结论沉默BHRF1可抑制细胞增殖并诱导G1/G0期阻滞及细胞凋亡。

shRNA；BHRF1；鼻咽癌；生长；凋亡

鼻咽癌为一种恶性头颈肿瘤，发病隐匿，恶性度高，易发生远处转移。调强放疗技术提高了鼻咽癌局控率，但总生存率仍较低。故研究其发生和转移的分子机制对提高其疗效意义重大[1]。EB病毒感染可能为鼻咽癌发生、发展的有关，而EB病毒早期基因BHRF1为近年来新确认的一种EB病毒致癌基因，与原癌基因bcl-2同源，具有抑制细胞凋亡的作用[2]，故探讨以BHRF1为靶点对EBV相关鼻咽癌进行治疗具有巨大的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂：CNE2细胞株购自美国ATCC公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲亚砜（DMSO）及Tris购自美国Sigma-Aldrich公司；细胞裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒及ECL化学发光检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；RPMI 1640培养基、胎牛血清及胰蛋白酶购自美国Gibco公司；PI细胞周期流式检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。负载BHRF1 shRNA的慢病毒载体由北京诺赛公司构建。

1.2 细胞增殖检测：制备对数生长期CNE2细胞单细胞悬液，以1×105个/孔接种于96孔培养板，24 h后转染BHRF1 shRNA慢病毒（取未处理者为对照），常规条件下培养24、48、72和96 h后，加入MTT溶液并读取492 nm的吸光值A，根据公式计算增殖抑制率（%）=（1-实验组A/对照组A）×100%。

1.3 细胞凋亡及细胞周期检测：按1×106/孔接种细胞于6孔培养板中，转染BHRF1 shRNA慢病毒（取未处理者为对照），常规条件培养48 h后，依据凋亡检测试剂盒说明书操作，PBS冲洗细胞1次，15 min后采用流式细胞仪测定凋亡率及细胞周期。

1.4 统计学处理：数据均以平均数±标准差表示，单因素方差进行多组比较，SNK法行两两比较，采用SPSS 18.0软件分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞增殖：转染BHRF1 shRNA载体24、48、72及96 h的增殖抑制率分别为（7.21±0.56）%、（16.55±2.71）%、（25.08±3.14）%和（38.44±3.39）%，其中96 h时达最大程度抑制，各观察点的差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 细胞凋亡：shRNA载体组的早、晚期凋亡率分别为（8.21± 0.75）%和（26.15±3.39）%，均高于对照组的（3.45±0.46）%和（9.22±1.12）%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 细胞周期：shRNA载体组的G1/G0期细胞比例为（78.51±3.83）%，高于对照组的（55.24±2.59）%，S、G2/M期细胞比例分别为（13.47±2.65）%和（7.66±0.92）%，低于对照组的（28.15±2.08）%和（12.73 ±1.69）%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

BHRF1为EBV裂解早期表达的蛋白，近年来备受关注的导致细胞恶性转化的病毒癌基因[3]。BHRF1基因位于EBV基因组，编码17 kDa蛋白质，属于bcl-2家族。BHRF1蛋白有25%的氨基酸序列与人类原癌基因bcl-2的编码蛋白同源，42%的序列相似，而C区38%的氨基酸序列与bcl-2序列同源[4-5]。研究发现BHRF1有原癌基因的作用[5]，但目前其对鼻咽癌细胞的作用尚不清楚，故本研究采用RNA干扰技术，在人鼻咽癌CNE2细胞中转染将负载BHRF1 shRNA慢病毒载体，观察BHRF1基因沉默对CNE2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。

本研究发现：转染BHRF1 shRNA可抑制CNE2细胞的增殖，表现为随观察时间的延长，增殖抑制率升高，且96h达最大抑制效果，主要与慢病毒可较长时间的表达有关，可起到长期抑制CNE2细胞增殖的效果。此外，转染48 h的CNE2细胞凋亡率升高，与对照组比较差异均有统计学意义，提示沉默BHRF1后可诱导鼻咽癌细胞的凋亡，主要与BHRF1与原癌基因bcl-2同源，具有抑制细胞凋亡的作用，故当沉默其表达后细胞早、晚期凋亡率均增加。细胞周期紊乱为肿瘤细胞的基本特征之一，转染BHRF1 shRNA后可引起G1/G0期细胞比例升高，S、G2/M期细胞比例降低，表明沉默BHRF1表达后可引起细胞周期的G1/G0期阻滞。综合以上证据，说明BHRF1蛋白在鼻咽癌细胞中的表达可增强细胞抵抗凋亡的能力，BHR F1基因的表达可抑制细胞的终末分化和细胞凋亡的发生。

综上所述，沉默BHRF1可抑制细胞增殖并诱导G1/G0期阻滞及细胞凋亡，在鼻咽癌的辅助治疗中，有一定的应用前景，值得进一步深入研究。

[1]Setton J,Wolden S,Caria N,et al.Definitive treatment of metastatic nasopharyngeal carcinoma: Report of 5 cases with review of literature [J].Head Neck,2012,34(5):753-757.

[2]Li Z,Chen X,Li L,et al.EBV encoded miR-BHRF1-1 potentiates viral lytic replication by down regulating host p53 in nasopharyngeal carcinoma [J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(2):275-279.

[3]孙静,孙强明,李建芳,等.EB病毒BHRF1基因慢病毒载体的构建及功能鉴定[J].现代肿瘤医学,2013,21(6):1197-1201.

[4]孔祥硕,李欣,罗兵,等.BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响[J].齐鲁医学杂志,2011,26(5):377-380.

[5]张伟,王爱亮,崔凯,等.EBVaGC中LMP1和BHRF1的表达与血管生成淋巴管生成的关联性研究[J].济宁医学院学报,2013,36(3): 200-203.

R739.6

B

1671-8194（2015）05-0055-01

2012年度湖南省高等学校科学研究项目12C0968

*通讯作者