机械刺激对小鼠子宫内膜组织形态及ICAM-1的影响

罗国群，马文敏，陈孟循，叶泉英，赵 军，朱 莉

(1.佛山市妇幼保健院生殖医学中心，广东 佛山 528000；2.佛山市科技学院药理教研室，广东 佛山 528000)

机械刺激对小鼠子宫内膜组织形态及ICAM-1的影响

罗国群1，马文敏1，陈孟循1，叶泉英2，赵 军1，朱 莉1

(1.佛山市妇幼保健院生殖医学中心，广东 佛山 528000；2.佛山市科技学院药理教研室，广东 佛山 528000)

目的 探讨机械刺激对子宫内膜容受性影响的机理。方法 将96只雌性小白鼠随机分成对照组和刺激组。对照组在小鼠动情前期不刺激子宫内膜，在动情期刮取子宫内膜。刺激组在小鼠动情前期先接受特制小号刮匙刺激子宫内膜1次，在动情期刮取子宫内膜。对两组的子宫内膜进行图像分析，并采用免疫组织化学法检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达。结果 子宫内膜ICAM-1免疫组化阳性着色主要分布于子宫内膜腔上皮、腺上皮和基质细胞的胞浆中。刺激组子宫内膜腺/间比值较对照组高，差异有极显著性意义(t=18.36，P<0.01)。刺激组ICAM-1表达较对照组的ICAM-1表达强，差异有极显著意义(t=11.63，P<0.01)。结论 推测机械刺激提高子宫内膜的容受性与促使子宫内膜腺体发育、增加子宫内膜容受性标志物的表达有关。

机械刺激；子宫内膜；容受性；细胞间黏附分子-1

胚胎着床是从胚泡植入子宫内膜开始的一系列细胞、分子信号传递过程，成功的着床不仅取决于胚胎的质量，而且取决于子宫内膜的容受性。子宫内膜容受性是指子宫内膜对胚胎的接受能力，即允许胚胎黏附其上直至植入完成的特定阶段，它受严格的时空限制。体外受精-胚胎移植(IVF-ET)着床失败的病例中约有2/3是由于子宫内膜容受性不良导致的，因此，提高子宫内膜容受性对提高胚胎着床率及临床妊娠率非常重要。

对子宫内膜回声紊乱或子宫内膜异常增厚的患者，采用机械刺激子宫内膜可以提高患者胚胎着床率、临床妊娠率和活产率，但对其机理尚缺少理论研究。本研究将用动物模型，比较未接受机械刺激和机械刺激子宫内膜的组织形态结构，从组织形态结构探讨机械刺激对子宫内膜的影响，寻找调节子宫内膜胚胎着床的分子生物学基础，为人工调控子宫内膜接受性提供可靠的理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 动物分组

2013年2至6月选取清洁级、体重为20～25g的雌性8周龄昆明小白鼠(购于中山大学实验动物中心)。雌性小白鼠动情周期为4～5d，分为4期：动情前期、动情期、动情后期和动情间期。每日上午9:00时取小白鼠阴道分泌物涂片行HE染色检查，确定其动情周期，连续2个动情周期均正常，将小白鼠编号，用Excel分析工具中随机数字发生器产生随机数字，对应随机数字将小白鼠分成对照组和刺激组，每组48只。

1.2 机械刺激子宫内膜方法及标本的采集

对照组在小鼠动情前期将刮匙放进子宫但不刺激内膜，在动情期刮取子宫内膜；刺激组在小鼠动情前期用特制小号刮匙刺激子宫内膜，动情期刮取子宫内膜。将两组所刮取的新鲜子宫内膜用生理盐水反复冲净后放入4%多聚甲醛中固定，制成石蜡切片(4μm)，所有子宫内膜标本常规固定、脱水、石蜡包埋、切片后行HE染色，用作图像分析及免疫组化检测细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)。

1.3 标本制备与分析

1.3.1 图像分析

将子宫内膜切片置于OLYM-PUS显微镜下，用MIAS多功能图像分析仪在高倍镜下(×100)采集图像，每张切片选择10个视野进行测量，选取其中具代表性的5帧，每例标本的结果为5帧画面的平均值。

视野选择及检测标准：每个待测视野腺体数不少于3个。为了避免所测腺体因测量切面不同产生误差，统一对腺体的横切面进行测量(腺体纵横径之比不超过3∶1)。待测视野经摄像系统扫描后显示于电脑荧光屏上，用鼠标分别勾画被测腺体基底面(外侧轮廓)和腺腔面(内腔轮廓)，计算机分析系统测量并计算每个视野腺体面积/间质面积比(简称腺/间比值，反映腺体密度)。

计算公式：每个视野腺体(腺上皮细胞)面积(%)=每个视野腺体面积之和/每个视野固定面积×100%。每个视野间质面积(%)=(每个视野固定面积-每视野腺体总面积)/每个视野固定面积×100%。

1.3.2 免疫组化检测

采用免疫组化SP法，标本经固定、包埋、制成蜡块、切片、脱蜡至水、高压修复的标准免疫组织化学操作程序，DAB显色，采用鼠ICAM-1 IgG单克隆抗体和免疫组织化学试剂盒(均购自北京中山试剂公司)，每批免疫组化均设有用PBS代替一抗的阴性对照。ICAM-1均以细胞浆内出现明确的棕黄色颗粒为阳性细胞。

根据Watanabe等的免疫组织化学半定量评分标准，每张切片任意选5个视野，观察其阳性细胞胞浆表达强度，无表达为阴性(-)记0分、阳性颗粒呈浅黄色为可疑阳性(±)记1分、浅棕色为弱阳性(+)记2分、棕黄色为阳性(++)记3分、棕褐色为强阳性(+++)记4分。

计算阳性细胞百分数(5个视野的平均数)，无表达为阴性记0分、1%～15%为可疑阳性记1分、16%～50%为弱阳性记2分、51%～85%为阳性记3分、86%～100%为强阳性记4分。

标本的阳性指数=(阳性细胞表达强度×阳性细胞百分数)/2。每份标本都由固定的2人同时观察完成。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 组织形态特征

对照组的子宫内膜表现为腺腔轻度扩大、弯曲较小，腺上皮细胞整齐地排列成一圈，高柱状，核卵圆形，位于细胞中部，见核下空泡；间质水肿不明显，见图1。

刺激组的子宫内膜表现为子宫内膜腺体弯曲、腺腔大，腺体间靠近，腺腔内有分泌物，腺上皮细胞柱状单层排列，核圆形，位于细胞基底部，核质均匀略深，顶浆分泌旺盛；间质轻度水肿，细胞呈卵圆形或星形，核卵圆形，见图2。

刺激组子宫内膜腺/间比值较对照组高，差异有显著统计学意义(P<0.01)，见表1。

图2 刺激组的子宫内膜组织形态(HE×100)

Fig.2 Endometrial histomorphology of the stimulation group(HE×100)

2.2 分子生物学标志

小白鼠子宫内膜ICAM-1免疫组化阳性着色主要分布于子宫内膜腔上皮、腺上皮和基质细胞的胞浆中，对照组ICAM-1蛋白呈阳性(++)表达，刺激组ICAM-1蛋白呈强阳性(+++)表达，见图3、图4。

刺激组ICAM-1蛋白表达较对照组的ICAM-1蛋白表达强，差异有显著统计学意义(P<0.01)，见表1。

图3 对照组ICAM-1蛋白的阳性(++)表达(SP×200)Fig.3 Positive expression of ICAM-1 protein in the control group(SP×200)

图4 刺激组ICAM-1蛋白的强阳性(+++)表达(SP×200)

Fig.4 Strong-positive expression of ICAM-1 protein in the stimulation group(SP×200)

3 讨论

3.1 提高子宫内膜容受性的意义

正常子宫内膜仅在一个极短的关键时期内允许胚胎着床，这一时期代表着子宫内膜对胚胎的接受性达到最高，称为“着床窗”(nidation window)，或称“种植窗”(implantation window，IW)，又称为“着床窗期”(peri-implantation period)。人类的此期通常在正常月经周期排卵后的6～8d，或受精后5～7d，持续不超过48h；在大鼠、小鼠等啮齿类动物中，种植窗在受精后4d，持续约24h。胚胎只有在这一时期才能植入，在种植窗开放前或后，胚胎都不能植入。

IVF-ET失败的原因有1/3归因于胚胎质量欠佳，另外2/3归因于子宫内膜容受性差。内膜不成熟或不处于着床窗口期，即使移植优质的胚胎，也会导致很低的着床率。胚胎着床的成功与否在很大程度上还取决于胚胎与可容受性子宫内膜间的相互作用，即双方建立“对话”机制，胚胎才可以在子宫内膜中正常着床[1]。

子宫内膜的超声形态分为3种类型：A型为三线型或多层子宫内膜，为外层和中部强回声以及内层低回声或暗区，宫腔中线回声明显；B型为弱三线型，宫腔中线回声不明显；C型为均质强回声，无宫腔中线回声。人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射日子宫内膜回声类型和胚胎着床率相关，子宫内膜回声紊乱或子宫内膜异常增厚可能会影响子宫内膜容受性，阻止胚胎着床。

因此，提高子宫内膜容受性对提高胚胎着床率及临床妊娠率非常重要。

3.2 机械刺激子宫内膜对子宫内膜容受性的影响

目前已经有很对研究证实可以通过对子宫内膜进行搔刮，提高子宫内膜的着床率。Narvekar等[2]选择了100例前次移植优质胚胎而失败的患者，分为子宫内膜机械刺激组及对照组，发现机械刺激组其胚胎着床率、临床妊娠率和活产率均显著高于对照组(13.07% vs. 7.1%；32.7% vs. 13.7%；22.4% vs. 9.8%)。Potdar等[3]将7个对照研究(4个随机试验，3个非随机试验)进行了Meta分析，结果显示，在反复种植失败(recurrent implantation failure，RIF)患者促排卵周期中行子宫内膜机械刺激，临床妊娠率在70%左右，说明机械刺激子宫内膜可以提高RIF患者的临床妊娠率。罗国群等[4]选取行IVF-ET且其自然月经周期卵泡晚期超声提示子宫内膜形态不良的不育患者63例，随机分为研究组和对照组。研究组在胚胎移植前1～2周对子宫内膜行机械刺激，对照组未行机械刺激，发现研究组子宫内膜形态及子宫内膜和内膜下血流均较对照组有明显改善(均P<0.01)；研究组的胚胎种植率及临床妊娠率明显高于对照组(P<0.01)，早期流产率明显降低(P<0.01)。

可见，机械刺激子宫内膜有助于改善IVF-ET的妊娠结局，其作为提高胚胎着床率的有效途径，对于IVF助孕后的妊娠极具价值。

3.3 机械刺激子宫内膜提高子宫内膜容受性的作用机制

机械刺激子宫内膜能够提高子宫内膜容受性，但其作用机制不甚明确。

Loeb等在1907年观察到，局部损伤几内亚猪的子宫内膜，能够促其快速蜕膜化，其蜕膜细胞的发育完全等同于正常蜕膜细胞的发育。Dekel等[5]研究认为，机械刺激子宫内膜是通过提高免疫应答而增加子宫内膜的容受性。Gnainsky等[6]认为机械刺激子宫内膜后，在局部会产生炎症反应，使巨噬细胞和树突状细胞(DC)含量增加，两者在子宫内膜的蜕膜化和着床方面起非常重要的作用。罗国群等[4]，机械刺激子宫内膜可以促进上皮细胞和基质细胞的增生和分化，以及调节毛细血管的舒缩活动，提高子宫内膜的血流量，增加基质的水肿和蜕膜化，从而促进胚胎着床。Almog等[7]认为，机械刺激子宫内膜可以通过调节对着床起重要作用的相关因子如层粘连蛋白a4、整合素a6的表达来提高子宫内膜的容受性。Kalma等[8]认为，机械刺激通过增加生长因子的分泌使子宫内膜容受性提高。

子宫内膜种植窗出现的一些形态学和分泌蛋白等的变化，表现为胞饮突出现，黏附分子、细胞因子、生长因子以及免疫分子上调或下调，这些变化可作为种植窗开放的标志[9]。ICAM-1是一种跨膜糖蛋白，持续表达于所有类型细胞的表面。ICAM-1目前被认为是种植窗预测的金标准。它在子宫内膜上皮细胞表面、腺体表层细胞表面或是细胞外基质中呈现时间、空间的特异性表达，并被认为在胚胎的着床过程中起重要作用。

本研究应用图像分析技术对小鼠子宫内膜组织形态特征进行检查，结果发现刺激组的子宫内膜分泌反应较对照组有明显改善，刺激组子宫内膜腺/间比值较对照组高，差异有显著统计学意义(P<0.01)。本研究应用免疫组化检测小鼠子宫内膜ICAM-1的表达，发现ICAM-1免疫组化阳性着色主要分布于子宫内膜腔上皮、腺上皮和基质细胞的胞浆中。刺激组的ICAM-1表达较对照组的ICAM-1表达强，差异有统计学意义(P<0.05)。

本研究结果认为机械刺激可使子宫内膜腺体/间质比值增加，增强子宫内膜容受性标志物如ICAM-1的表达，推测机械刺激提高子宫内膜的容受性与促使子宫内膜腺体发育、增加子宫内膜容受性标志物的表达有关。

[1]Heger A,Sator M,Pietrowski D.Endometrial Receptivity and its Predictive Value for IVF/ICSI-Outcome[J].Geburtshilfe Frauenheilkd,2012,72(8):710-715.

[2]Narvekar S A, Gupta N, Shetty N,etal.Does local endometrial injury in the nontransfer cycle improve the IVF-ET outcome in the subsequent cycle in patients with previous unsuccessful IVF? A randomized controlled pilot study[J].J Hum Reprod Sci,2010,3(1):15-19.

[3]Potdar N, Gelbaya T, Nardo L G.Endometrial injury to overcome recurrent embryo implantation failure:a systematic review and meta-analysis[J].Reprod Bio Med Online,2012,25(6):561-571.

[4]罗国群,邓伟芬,马文敏.机械刺激子宫内膜对内膜形态不良者IVF-ET临床结局的影响[J].生殖与避孕,2012,32(2):139-143.

[5]Dekel N, Gnainsky Y, Granot I,etal.Inflammation and implantation[J].Am J Reprod Immunol,2010,63(1):17-21.

[6]Gnainsky Y, Granot I, Aldo P B,etal.Local injury of the endometriuminduces an inflammatory response that promotes successful implantation[J].Fertil Steril,2010,94(6):2030-2036.

[7]Almog B, Shalom-Paz E, Dufort D,etal.Promoting implantation by local injury to the endometrium[J].Fertil Steril,2010,94(6):2026-2029.

[8]Kalma Y, Granot I, Gnainsky Y,etal.Endometrial biopsyinduced gene modulation:first evidence for the expression bladder-transmembranal uroplakin Ib in human endometrium[J].Fertil Steril,2009,91(4):1042-1049.

[9]吕忠梅,蔡霞.子宫内膜容受性相关标志物的研究进展[J].中国妇幼健康研究,2013,24(6):958-960.

[专业责任编辑：张忠明]

Effect of mechanical stimulation on mice endometrial histomorphology and ICAM-1 expression

LUO Guo-qun1, MA Wen-min1, CHEN Meng-xun1, YE Quan-ying2, ZHAO Jun1, ZHU Li1

(1.ReproductiveMedicineCenterofFoshanMaternalandChildren’sHospital,GuangdongFoshan528000,China;2.PharmacologyTeachingandResearchSection,FoshanUniversity,GuangdongFoshan528000,China)

Objective To study the effect of mechanical stimulation on endometrial receptivity. Methods A total of 96 female mice were randomly divided into control group and stimulation group. In stimulation group, emdometrium was scraped both in proestrus and estrus, compared with that only in estrus in control group. Endometrial images of two groups were analyzed and the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) protein in endometrium was determined by immunohistochemistry. Results The expression of ICAM-1 was mainly distributed in the cytoplasm of the luminal epithelium, glandular and stroma cells. The ratio of gland/stroma in the stimulation group was significantly higher compared with the control group, and the difference was significant (t=18.36,P<0.01). The expression of ICAM-1 in the stimulation group was significantly higher than that in the control group with significant difference (t=11.63,P<0.01).Conclusion Mechanical stimulating improves the endometrial receptivity by improving the development of endometrial gland and increasing the expression of ICAM-1.

mechanical stimulation；endometrium；receptivity；intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)

2015-02-01

本课题为佛山市科技局立项资助项目(项目编号:201208008)

罗国群(1968-)，女，主任医师，硕士，主要从事生殖医学的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.011

R711.5;R361.3

A

1673-5293(2015)05-0941-03