GSK3β、p-GSK3βser9、p-GSK3βTyr216在宫颈癌组织中的表达及临床意义

陈良凤，张 颖，王仲奇，邸 曼，郑福利，王 建

(1.第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710032；2.安康市中心医院妇产科，陕西 安康 725000；3.解放军第三二三医院妇产科，陕西 西安 710054；4.陕西中医学院第二附属医院妇产科，陕西 咸阳 712000)

GSK3β、p-GSK3βser9、p-GSK3βTyr216在宫颈癌组织中的表达及临床意义

陈良凤1，2，张 颖1，3，王仲奇2，邸 曼1，郑福利4，王 建1

(1.第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710032；2.安康市中心医院妇产科，陕西 安康 725000；3.解放军第三二三医院妇产科，陕西 西安 710054；4.陕西中医学院第二附属医院妇产科，陕西 咸阳 712000)

目的 检测糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表达水平在宫颈癌组织中的表达情况及其与临床病理因素的相关性。方法 收集2012年1月至2014年12月间第四军医大学西京医院妇产科收治的宫颈鳞癌病理标本80例，采用免疫组化SP法对宫颈癌组织中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表达水平进行检测，并分析GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表达与临床病理因素之间关系。结果 宫颈癌组织中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表达阳性率分别为18.8%、68.8%和12.5%。早期宫颈癌患者中GSK3β和p-GSK3βTyr216表达显著高于中晚期宫颈癌患者(25.5% vs. 4.0%，χ2=5.193，P=0.029；76.4% vs 52.0%，χ2=4.749，P=0.039)，早期宫颈癌患者中p-GSK3βser9表达显著低于中晚期宫颈癌患者(5.5% vs. 28.0%，χ2=7.988，P=0.009)。在宫颈癌组织中随着细胞学分级的降低，p-GSK3βser9阳性率也随之升高(7.4%、7.9%和33.3%，χ2=7.329，P=0.031)。淋巴结转移阳性的宫颈癌患者中GSK3β和p-GSK3βTyr216表达均显著低于淋巴结转移阴性的宫颈癌患者(5.9% vs. 28.3%，χ2=6.427，P=0.018；52.9% vs. 80.4%，χ2=6.878，P=0.014)，p-GSK3βser9在淋巴结转移阳性的宫颈癌患者中表达显著高于淋巴结转移阴性的宫颈癌患者(23.5% vs. 4.3%，χ2=6.577，P=0.015)。结论 宫颈癌组织中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表达与宫颈癌临床分期、细胞学分级和淋巴结转移相关，提示GSK3β基因可能在宫颈癌组织发生发展中发挥重要作用。

宫颈；肿瘤；糖原合成酶激酶3β；免疫组织化学

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，我国作为发展中国家，宫颈癌发病率高居世界第2位，近年来宫颈癌粗发病率以平均每年8.7%的速度呈逐年上升趋势，发病年轻化趋势明显[1-2]。由此可见，我国宫颈癌造成的疾病负担和经济负担日益严重，防治形势十分严峻。目前宫颈癌的具体发病机制仍不清楚，寻找宫颈癌发生发展中的关键基因一直以来都是研究热点。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)是丝氨酸/苏氨酸家族激酶GSK3的两个亚型之一，编码433个氨基酸，包括3个结构域，可通过参与Wnt、Akt、Hedgehoog等多种信号通路，对细胞周期、细胞凋亡、细胞侵袭/转移、糖代谢、血管生成等多个重要生物学活动进行调控[3-4]。GSK3β生物学功能强大，被公认是信号转导通路中决定细胞命运的关键激酶，一直以来都是肿瘤领域的研究热点。磷酸化位点活化是GSK3β活性调控的主要方式之一。GSK3β基因的ser9位点磷酸化可使GSK3β功能失活，Tyr216位点磷酸化则可激活GSK3β的功能。本研究中利用免疫组化探讨宫颈病变及宫颈癌组织中的GSK3β表达情况及其磷酸化水平，对于深入理解GSK3β在宫颈癌的发生发展中所扮演角色具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2012年1月至2014年12月间第四军医大学西京医院妇产科收治的宫颈鳞癌病理标本80例。病例纳入标准为：①初次诊治宫颈鳞癌患者，术前未经任何治疗；②经组织病理学明确诊断为宫颈鳞癌；③临床资料完整。所有病例病理切片均经过常规光镜观察，重新复核诊断。详细记录宫颈癌患者的症状体征、病理类型、细胞学分级、临床分期、淋巴结转移及宫旁浸润情况、术后治疗及随访等临床资料并进行统计分析。

1.2 免疫组化方法

采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化法(Streptavdin-Peroxidase，SP)对宫颈癌组织中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216进行检测。小鼠抗人GSK3β、p-GSK3βser9、p-GSK3βTyr216单克隆抗体购自美国CST公司，SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂购自北京中杉金桥公司。将组织蜡块连续切片为4μm，60℃烤箱加热烤片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精至水化，按照说明书常规进行SP法免疫组化，GSK3β、GSK3βser9、GSK3βTyr216单克隆抗体使用浓度均为1:1 000，抗小鼠二抗使用浓度为1:200。采用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 免疫组化结果判读

免疫组化结果由两位经验丰富的病理科医生在不清楚患者临床资料的情况下分别独立完成判读。随机选择5个视野，显微镜下细胞中出现棕黄色或棕褐色颗粒为表达阳性。

1.4 统计学方法

依据患者临床病理因素对照GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216染色结果，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，分组资料之间比较采用χ2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌患者一般临床情况

收集第四军医大学西京医院妇产科收治术前未接受任何治疗的宫颈鳞癌初治患者80例，患者年龄33～56岁，平均46.28±9.51岁。临床分期：早期55例，晚期25例；按细胞学分级分为：高分化27例，中分化38例，低分化15例。在80例宫颈癌患者中，发生淋巴结转移34例，宫旁浸润5例。

2.2 糖原合成酶激酶3β及其磷酸化蛋白在宫颈癌组织中的表达情况

宫颈癌组织中GSK3β为胞浆表达，阳性率为18.8%(15/80)，p-GSK3βser9主要为胞浆和胞核共表达，阳性率为12.5%(10/80)，p-GSK3βTyr216主要为胞浆表达，也可见胞浆胞核共表达，阳性率为68.8%(55/80)，见图1。

注：A为宫颈癌组织中GSK3β呈胞浆表达；B为宫颈癌组织中p-GSK3βser9呈核浆共表达；C为宫颈癌组织中p-GSK3βTyr216呈核浆共表达。

图1 宫颈癌组织中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216的表达(SP×100)

Fig.1 Expressions of GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216in cervical carcinoma tissues (SP×100)

2.3 糖原合成酶激酶3β及其磷酸化蛋白表达与宫颈癌临床病理因素的关系

对宫颈癌中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表达情况与宫颈癌临床病理因素的相关性进行分析，结果表明GSK3β和p-GSK3βTyr216在早期(Ⅰ+Ⅱ)宫颈癌患者中表达均显著高于中晚期(Ⅲ+Ⅳ)宫颈癌患者(25.5% vs. 4.0%，χ2=5.193，P=0.029；76.4% vs. 52.0%，χ2=4.749，P=0.039)，p-GSK3βser9在早期(Ⅰ+Ⅱ)宫颈癌患者中表达显著低于中晚期(Ⅲ+Ⅳ)宫颈癌患者(5.5% vs. 28.0%，χ2=7.988，P=0.009)。p-GSK3βser9在高分化、中分化、低分化宫颈癌组织中表达阳性率分别为7.4%，7.9%和33.3%，随着细胞学分级降低，p-GSK3βser9阳性率也随之升高(χ2=7.329，P=0.031)，而GSK3β和p-GSK3βTyr216阳性率在不同细胞学分级宫颈癌患者中差异无统计学意义(均P>0.05)。GSK3β和p-GSK3βTyr216在淋巴结转移阳性的宫颈癌患者中表达均显著低于淋巴结转移阴性的宫颈癌患者5.9% vs. 28.3%，χ2=6.427，P=0.018；52.9% vs. 80.4%，χ2=6.878，P=0.014)，p-GSK3βser9在淋巴结转移阳性的宫颈癌患者中表达显著高于淋巴结转移阴性的宫颈癌患者(23.5% vs. 4.3%，χ2=6.577，P=0.015)。此外GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表达在发生宫旁浸润的宫颈癌患者和未发生宫旁浸润的宫颈癌患者之间差异无统计学意义(均P>0.05)。

3 讨论

宫颈癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，我国是宫颈癌高发地区，据报道，目前我国宫颈癌发病率以平均每年14.4%～22.5%的速度递增，宫颈癌的防治形势日益严峻[1]。通过对宫颈癌发生发展中的关键基因及信号通路的探索研究将有助于宫颈癌癌前病变的早期发现和治疗，具有重要的临床意义。

3.1 糖原合成酶激酶3β在肿瘤组织中作用具有组织特异性

GSK3β属于丝氨酸/苏氨酸类激酶，生物学功能复杂，在肿瘤细胞的细胞分化、细胞周期、细胞凋亡、侵袭/转移、转录因子调控等方面发挥重要作用[3-5]。GSK3β在肿瘤发生发展中的作用具有较大争议，主要原因为GSK3β具有组织特异性。现已证实前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中GSK3β表达增高[6-7]，过表达激活型GSK3β可促进cyclinD1等细胞周期相关基因表达增加，促进肿瘤细胞增殖和存活；而抑制GSK3β活性可显著抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞死亡[8-9]。但是也有一些研究表明，在口腔癌、食管癌、鼻咽癌等肿瘤组织中出现GSK3β失活即p-GSK3βser9表达增加，提示GSK3β对于某些肿瘤具有抑癌作用[10-11]。由于GSK3β对于不同的肿瘤具有组织特异性，因此探索不同类型肿瘤组织中GSK3β及其磷酸化水平对于深入理解GSK3β在肿瘤发生发展中的作用机制具有重大意义。目前宫颈癌组织中GSK3β及其磷酸化水平的研究尚未见报道。

3.2 宫颈癌组织中糖原合成酶激酶3β及其磷酸化蛋白表达与临床分期、细胞学分级和淋巴结转移相关

本研究用免疫组化对80例宫颈癌组织中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表达进行了检测，结果显示宫颈癌组织中GSK3β阳性率仅为18.8%。对GSK3β、p-GSK3βser9(GSK3β失活)和p-GSK3βTyr216(GSK3β激活)表达与宫颈癌临床病理因素的关系进行统计分析，结果表明GSK3β和p-GSK3βTyr216阳性率在早期宫颈癌组织中显著高于晚期宫颈癌组织，而p-GSK3βser9阳性率在早期宫颈癌组织中显著低于晚期宫颈癌组织(均P<0.05)。此外，GSK3β和p-GSK3βTyr216在宫颈癌淋巴结转移阳性的肿瘤组织中表达阳性率显著低于淋巴结转移阴性的肿瘤组织，而p-GSK3βser9在宫颈癌淋巴结转移阳性的肿瘤组织中表达阳性率显著高于淋巴结转移阴性的肿瘤组织(均P<0.05)。上述结果表明，在宫颈癌发展过程中GSK3β蛋白表达及活性逐渐降低，提示GSK3β可能在宫颈癌组织中为抑癌基因。值得注意的是，随着细胞学分级降低，p-GSK3βser9阳性率也随之升高，而GSK3β和p-GSK3βTyr216阳性率在不同细胞学分级宫颈癌患者中差异无统计学意义(均P>0.05)。这一结果提示GSK3β活性降低促进了宫颈癌的恶性转化。有研究表明，GSK3β磷酸化失活可激活Wnt信号通路，通过维持β-catenin的稳定促进肿瘤细胞的恶性转化[12-13]。

综上所述，在宫颈癌发展过程中GSK3β蛋白表达及活性逐渐降低，提示GSK3β基因可能在宫颈癌组织中为抑癌基因，但GSK3β基因及其磷酸化水平在宫颈癌发生发展中的具体机制还有待进一步深入研究探讨。

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[专业责任编辑：张忠明]

Expression and clinical significance of GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216in cervical carcinoma

CHEN Liang-feng1,2, ZHANG Ying1,3, WANG Zhong-qi2, DI Man1, ZHENG Fu-li4, WANG Jian1

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China;2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,AnkangCityCentralHospital,ShaanxiAnkang725000,China;3.DepartmentofGynecologyandObstetrics,PLA323Hospital,ShaanxiXi’an710054,China;4.DepartmentofGynecologyandObstetrics,SecondAffiliatedHospital,ShaanxiCollegeofTraditionalChineseMedicine,ShaanxiXianyang712000,China)

Objective To investigate the expressions of glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216in cervical carcinoma and their correlation with clinical pathological factors. Methods By using immunohistochemistry, GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216protein expressions were detected in 80 cases of cervical carcinoma admitted in Xijing Hospital of Fourth Military Medical University during January 2012 to December 2014. The correlations between expressions of GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216and clinicopathological factors were analyzed. Results The positive expression rates of GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216in cervical carcinoma were 18.8%, 68.8% and 12.5%, respectively. The expressions of GSK3β and p-GSK3βTyr216in early stage group were significantly higher than those in advanced stage group (25.5% vs 4.0%,χ2=5.193,P=0.029; 76.4% vs 52.0%,χ2=4.749,P=0.039), but the expression rate of p-GSK3βser9was obviously lower (5.5% vs 28.0%,χ2=7.988,P=0.009). The positive expression rates of p-GSK3βser9in well and moderately differentiated tumors were lower than those in poorly differentiated tumors (7.4%, 7.9% and 33.3%,χ2=7.329,P=0.031). The expressions of GSK3β and p-GSK3βTyr216were significantly lower in patients with positive lymph node metastasis than in those with negative lymph node status (5.9% vs 28.3%,χ2=6.427,P=0.018; 52.9% vs 80.4%,χ2=6.878,P=0.014), but the expression of p-GSK3βser9was higher in patients with lymph node metastases (23.5% vs 4.3%,χ2=6.577,P=0.015). Conclusion The expressions of GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216in cervical carcinoma are correlated with clinical TNM staging, histological grades and lymph node metastases, which suggests that GSK3β may play a potential role in cervical tumor genesis.

cervix; carcinoma; glycogen synthase kinase 3β(GSK3β); immunohistochemistry

2015-06-17

国家自然科学基金资助项目(编号：81172458)；国家自然科学基金青年基金资助项目(编号：81302243)

陈良凤(1981-)，女，陕西省安康市中心医院妇产科主治医生，现为第四军医大学西京医院妇产科在读研究生，主要从事妇科肿瘤的研究。

王 建，教授，第四军医大学西京医院妇产科主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.009

R737.33

A

1673-5293(2015)05-0934-04