卵泡液和胚胎培养液LIF与IVF-ET结局的关系

郝天羽，刘海萍，唐 宁，仉 燕

(济南军区总医院生殖中心，山东 济南 250000)

卵泡液和胚胎培养液LIF与IVF-ET结局的关系

郝天羽，刘海萍，唐 宁，仉 燕

(济南军区总医院生殖中心，山东 济南 250000)

目的 探讨卵泡液和胚胎培养液中白血病抑制因子(LIF)的表达水平与体外受精-胚胎移植(IVF-ET)结局的关系。方法 收集取卵日卵泡液、胚胎移植及冷冻后胚胎培养液，检测卵泡液中LIF、雌二醇(E2)、孕酮(P)和胚胎培养液中LIF的水平，分析卵泡液和胚胎培养液LIF与卵子质量、胚胎质量及临床结局的关系。结果 妊娠组胚胎培养液中LIF浓度显著高于未妊娠组(t=5.785，P<0.05)，而妊娠组卵泡液P浓度显著低于未妊娠组(t=4.475，P<0.05)。两组卵泡液LIF、E2浓度差异无统计学意义(t值分别为1.305、0.680，均P>0.05)。卵泡液LIF浓度与获卵数、成熟卵子率、卵裂率、优质胚胎率、E2均呈显著正相关(r值分别为0.285、0.394、0.302、0.387、0.476，均P<0.05)，卵泡液LIF与受精率、卵泡液P无显著相关性(r值分别为0.050、0.243，均P>0.05)。卵泡液LIF与移植胚胎胚胎培养液中LIF无显著相关性(r=0.107，P>0.05)。优质胚胎培养液中LIF水平显著高于劣质胚胎培养液中LIF水平(t=8.334，P<0.05)。结论 卵泡液中LIF与E2、卵母细胞质量有关，可以根据卵泡液中LIF评估卵母细胞的质量。胚胎培养液中LIF可以作为预测胚胎质量和妊娠结局的依据。

体外受精-胚胎移植；白血病抑制因子；卵泡液；胚胎培养液

随着辅助生殖技术的发展，越来越多的不孕症患者通过体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)实现了妊娠生子的愿望。如何准确、客观的评价胚胎质量，以此来选择植入潜力较强的胚胎，提高IVF-ET的妊娠率，是需要深入研究的问题。本研究旨在通过检测IVF-ET患者卵泡液及胚胎培养液中白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor，LIF)的表达，讨论LIF与卵子质量、胚胎发育及IVF-ET结局的关系，并进一步探讨卵泡液中LIF的表达与相应的移植胚胎培养液中LIF表达的关系，为临床评估卵母细胞和移植胚胎提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2013年5至10月在济南军区总医院生殖医学中心首次行IVF-ET的不孕患者共48人，年龄22～35岁，平均年龄29.40± 3.76岁，不孕年限3.58±1.61年，不孕原因为女方单纯输卵管梗阻或男方因素，女方性激素检查正常，排除多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)，近3个月内未应用激素类药物，无泌尿生殖系统感染性疾患，无严重的心血管、肝肾疾病，IVF-ET术前常规体格检查均未见异常。

1.2 研究方法

1.2.1 超促排卵、取卵、移植

均采用长方案超促排卵(controlled ovarian hypersti￣mulation，COH)，于IVF-ET前1个月经周期的黄体中期给予长效促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a)，于月经周期第3天检查患者达到垂体降调节标准后开始每日肌注促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG)，阴道超声检查当主导卵泡中有1个直径达18mm或3个达17mm时，或者外周血的雌二醇(estradiol,E2)水平达每个主导卵泡200～300pg/mL时，于当日20:00至22:00肌注人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)5 000～10 000IU，在注射hCG后36～38小时后经阴道超声显像引导下行卵泡穿刺术，根据患者具体情况行体外受精，受精后2～3天，选择形态学评分高的2个胚胎进行移植，其他多余的可移植胚胎进行冷冻保存。黄体支持从取卵日开始。在胚胎移植后的第14天，检测hCG以判断是否妊娠，如hCG阳性，则继续黄体支持，2～3周后行阴道超声检查，宫腔内见孕囊、卵黄囊及原始心管搏动者确定为临床妊娠。

1.2.2 胚胎质量的评估

受精卵卵裂成4～8细胞阶段的胚胎时，进行胚胎评分。

1级：胚胎发育速度正常，卵裂球均匀、数目均等，细胞质均一、无空泡，碎片不超过5%;2级：胚胎发育速度正常，卵裂球均匀或大致均匀，数目均等或大致均等，细胞质均一、无空泡，碎片占5%～10%;3级：胚胎发育速度大致正常，卵裂球不均匀/均匀、数目不均等/均等，细胞质中有少量空泡，碎片少于15%;4级：胚胎发育速度异常，卵裂球不均匀、数目不均等，细胞质不均一、有大量空泡，碎片占10%～50%。

优质胚胎为形态学评分为1级或2级的胚胎，劣质胚胎为形态学评分3级或4级的胚胎。

1.2.3 标本采集

1.2.3.1 卵泡液的收集 经阴道超声显像引导下，负压抽吸直径≥15mm的卵泡，留取第1管无血且不含卵泡冲洗液的卵泡液，立即置于离心机中，3 000rpm，离心10min，吸取上清液装入无菌试管，标记后贮存于-20℃冰箱保存，待测。

1.2.3.2 胚胎培养液的收集 收集每例患者移植后的胚胎培养液及冷冻后的优质与劣质胚胎培养液各1份，分别装入EPP管，标记后贮存于冰箱-20℃冰箱保存，待测。

1.2.4 标本检测

1.2.4.1 卵泡液雌二醇和孕酮的检测 采用化学发光法测定卵泡液中E2和孕酮(progesterone，P)，所有测定数据均由与其连接的计算机程序处理后得出结果。E2检测灵敏度为20pg/mL，P检测灵敏度0.1ng/mL。

1.2.4.2 卵泡液和胚胎培养液白血病抑制因子的检测 采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)双抗体夹心法检测卵泡液和胚胎培养液中LIF的浓度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 妊娠组与未妊娠组一般临床资料的比较

根据IVF-ET妊娠结局分为妊娠组和未妊娠组。妊娠组与未妊娠组患者的年龄、不孕时间、Gn用药天数、Gn用量、获卵数、成熟卵子率、受精率方面无统计学差异(均P>0.05)。妊娠组的卵裂率显著高于未妊娠组(χ2=3.778，P<0.05)。妊娠组的优质胚胎率高于未妊娠组，但差异无统计学意义(χ2=0.195，P>0.05)，见表1。

2.2 妊娠组与未妊娠组白血病抑制因子及卵泡液性激素水平的比较

妊娠组胚胎培养液中LIF浓度显著高于未妊娠组(t=5.785，P<0.05)，而妊娠组卵泡液P浓度显著低于未妊娠组(t=4.475，P<0.05)。两组卵泡液LIF、E2浓度差异无统计学意义(t值分别为1.305、0.680，均P>0.05)，见表2。

2.3 卵泡液白血病抑制因子与临床指标的关联性分析

卵泡液LIF浓度与获卵数、成熟卵子率、卵裂率、优质胚胎率、E2均呈显著正相关值(r值分别为0.285、0.394、0.302、0.387、0.476，均P<0.05)，卵泡液LIF与受精率、卵泡液P均无显著相关性(r值分别为0.050、0.243，均P>0.05)。

2.4 卵泡液白血病抑制因子与胚胎培养液中白血病抑制因子的关联性分析

卵泡液LIF与移植胚胎胚胎培养液中LIF无显著相关性(r=0.107，P>0.05)。

2.5 优质胚胎与劣质胚胎培养液中白血病抑制因子的比较

收集妊娠组与未妊娠组各级胚胎培养液共145份，分为优质胚胎培养液(n=77)和劣质胚胎培养液(n=68)，优质胚胎培养液中LIF水平为13.89±8.78pg/mL，显著高于劣质胚胎培养液中LIF水平10.35±5.35pg/mL，差异有统计学意义(t=8.334，P<0.05)。

3 讨论

卵泡液中含有的调节卵母细胞生长发育的细胞因子在生殖系统中的作用引起了研究者的关注，LIF是其中之一。LIF是白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)家族中的一员，是一种有多种生物学活性的细胞因子。90年代以来，相继发现其在胚胎的发育、分化、着床及卵泡的生长等方面起着关键作用，对于LIF在生殖的不同环节中的作用的研究越来越深入。

3.1 白血病抑制因子与卵子发育

卵泡液为卵母细胞成熟的微环境，其中含有调节卵母细胞生长发育的生长因子和细胞因子。Coskun等于1998年在人卵泡液中检测到LIF，而同期外周血中却难以检测到。本研究结果发现，妊娠组胚胎培养液中LIF浓度显著高于未妊娠组(P<0.05)，且卵泡液LIF浓度与获卵数、成熟卵子率、卵裂率、优质胚胎率、E2均呈显著正相关值(均P<0.05)，提示LIF在卵巢局部产生，可能通过自分泌和(或)旁分泌发挥作用，促进卵母细胞的发育、成熟和排卵，从而进一步提高卵裂率，增加优质胚胎的数目。将山羊的卵巢组织体外培养，含LIF的培养液中的卵巢组织的始基卵泡减少而初级卵泡增多，证明LIF能促进始基卵泡的活化，并能维持窦前卵泡的发育[1]。De Matos等[2]研究证实LIF可以诱导体外培养的人和小鼠卵丘复合体的卵丘扩展，体外培养液中加入重组FSH和LIF能显著提高小鼠卵母细胞的质量，提高小鼠胚胎的卵裂率、囊胚形成率和分娩率。研究发现，小鼠LIF作为颗粒细胞和卵泡膜细胞的增殖因子能促进窦前卵泡的生长[3]。在IVF-ET取卵后，除肉眼评估卵母细胞质量外，还可根据卵泡液中LIF的含量客观评价卵子质量，为评价卵子质量提供了要依据。

3.2 白血病抑制因子与胚胎发育和分化

Fukunaga等[4]在猕猴ESC分化培养液中加入LIF，发现LIF能抑制细胞减数分裂，增加碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的阳性细胞数目，表明体外分化培养液中加入LIF能促进猕猴ESC向生殖细胞的分化。Telugu等[5]研究发现依赖LIF的信号传递，猪囊胚内细胞团可以分化成多能干细胞。Neira等[6]在牛胚体外培养液中加入胰岛素样生长因子Ⅰ、Ⅱ(insulin-like growth，IGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor，TGF-β)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)和LIF后，发现这些因子联合作用后能促进受精后第9天牛胚的孵化。Mitchell等[7]将2细胞期鼠胚分成两组进行体外培养，一组加入5 000IU/mL的抗多克隆抗体，另一组加入5 000IU/mL的LIF，当培养至扩张的囊胚期时，移植入假孕鼠的宫腔内，结果发现与对照组相比，加LIF组的胚胎的植入率、妊娠率明显增加。Choi等[8]研究发现，猪卵母细胞和孤雌生殖胚胎的体外培养液中加入重组人LIF，能促进卵子的成熟和胚胎发育。本研究中，妊娠组胚胎培养液中LIF浓度显著高于未妊娠组(P<0.05)，且优质胚胎组的LIF水平也高于劣质胚胎组(P<0.05)，提示胚胎培养液中LIF的水平高，其所对应的胚胎质量好，同时该胚胎也具有更好的发育潜能，利于着床。本研究结果还发现，卵泡液中LIF水平与胚胎培养液中LIF水平无显著相关性(P>0.05)，可能因为采集卵泡液来自多个卵泡，其中的LIF反映的是多个卵泡液LIF的平均水平，胚胎培养液中LIF来自移植的2个胚胎，无法判断移植的胚胎是否是由采集的卵泡液中的卵子发育而来。

3.3 卵泡液中白血病抑制因子与雌二醇和孕酮的调控关系

动物实验证明，切除卵巢的兔体内检测不到LIF的表达，但是P可使LIF表达上调，而雌孕激素同时作用时则产生轻度的下调作用[9]。在人类，Piccinni等[10]研究发现P能诱导T细胞产生LIF，而LIF也受IL-4的调控，但Sawai等于1997年研究认为E2能促进LIF的产生，LIF的量随E2剂量的增加而增加，呈剂量依赖关系，而P和皮质类固醇激素没有这种作用。本研究结果发现，卵泡液中LIF水平与卵泡液中E2呈显著正相关(P<0.05)，与卵泡液中P无显著关联性(P>0.05)。推测在IVF-ET周期COH过程中，根据患者外周血E2水平判断卵子的成熟度，外周血的E2是由卵巢合成及分泌的，卵泡液中的E2水平随卵泡的发育而增加，于排卵前达高峰，卵泡液中的E2也反映卵子的成熟程度，研究发现卵泡液中LIF水平与卵子质量呈正相关[2]，提示卵泡液中LIF水平与E2有关。目前关于E2和P调节人LIF表达尚存在许多争议，不同物种间E2和P对LIF的作用有不同，推测可能为E2和P对LIF的表达的调节机制在不同分子水平、不同效应水平有差异，其机制需要进一步研究。

综上所述，本研究证实IVF-ET患者卵泡液和移植胚胎培养液中均表达LIF，卵泡液中LIF可以反映卵母细胞的质量，而胚胎培养液中LIF反映了胚胎的发育和种植潜能，预示着较好的妊娠结局。采用ELISA双抗夹心法检测卵泡液和胚胎培养液中LIF的表达情况可以为临床工作中优选卵母细胞和移植胚胎的提供一种新的、有效的非侵入性途径。

[1]da Nóbrega J E Jr, Gonçalves P B, Chaves R N,etal.Leukemia inhibitory factor stimulates the transition of primordial to primary follicle and supports the goat primordial follicle viability in vitro[J].Zygote, 2012,20(1):73-78.

[2]De Matos D G,Miller K,Scott R,etal.Leukemia inhibitory factor induces cumulus expansion in immature human and mouse oocytes and improves mouse two-cell rate and delivery rates when it is present during mouse in vitro oocyte maturation[J].Fertility and Sterility,2008,90(6):2367-2375.

[3]Haidari K,Salehnia M,Rezazadeh Valojerdi M.The effect of leukemia inhibitory factor and coculture on the in vitro maturation and ultrastructure of vitrified and nonvitrified isolated mouse preantral follicles[J].Fertility and Sterility,2008, 90(6):2389-2397.

[4]Fukunaga N,Teramura T, Onodera Y,etal. Leukemia inhibitory factor (LIF) enhances germ cell differentiation from primate embryonic stem cells[J].Cellular Reprogramming(Formerly‘Cloning and Stem Cells’),2010,12(4):369-376.

[5]Telugu B P,Ezashi T, Sinha S,etal.Leukemia inhibitory factor (LIF)-dependent, pluripotent stem cells established from inner cell mass of porcine embryos[J]. Journal of Biological Chemistry,2011, 286(33):28948-28953.

[6]Neira J A, Tainturier D, Pea M A,etal.Effect of the association of IGF-Ⅰ, IGF-Ⅱ, bFGF, TGF-beta1, GM-CSF, and LIF on the development of bovine embryos produced in vitro[J].Theriogenology, 2010,73(5):595-604.

[7]Mitchell M H,Swanson R J,Oehninger S.In vivo effect of leukemia inhibitory factor (LIF) and an anti-LIF polyclonal antibody on murine embryo and fetal development following exposure at the time of transcervical blastocyst transfer[J].Biology of Reproduction,2002,67(2):460-464.

[8]Choi Y B,Kim S J,Park E J,etal.91 effetc of leukemia inhibitory factor (LIF) on maturation of porcine oocytes in vitro maturation and development of parthenogenetic embryos[J].Reproduction,Fertility and Development,2013,26(1):159.

[9]Liu C,Yuan Y,Wang Z.Effects of leukaemia inhibitory factor on endometrial receptivity and its hormonal regulation in rabbits[J].Cell Biology International,2001,25(10):1029-1032.

[10]Piccinni M P,Scaletti C,Mavilia C,etal.Production of IL-4 and leukemia inhibitory factor by T cells of the cumulus oophorus:A favorable microenvironment for pre-implantation embryo development[J].European Journal of Immunology,2001,31(8):2431-2437.

[专业责任编辑：吕淑兰]

Relationship between the level of LIF in follicular fluid and embryo culture media and IVF-ET outcomes

HAO Tian-yu, LIU Hai-ping, TANG Ning, ZHANG Yan

(ReproductiveMedicineCentre,GeneralHospitalofJinanMilitaryArea,ShandongJinan250000,China)

Objective To explore the relationship between the level of leukaemia inhibitory factor (LIF) in follicular fluid and embryo culture media and the outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET). Methods Follicular fluid on the day of oocyte retrieval and embryo culture media after transfering and freezing were collected. The level of LIF, estradiol (E2), progesterone (P) in follicular fluid and level of LIF in embryo culture media were measured to analyze the relationship among LIF with the quality of oocyte, embryo and the outcomes of IVF-ET. Results The level of LIF in embryo culture media was significantly higher and the level of P in follicular fluid was lower in the pregnant group than in non-pregnant group (tvalue was 5.785 and 4.475, respectively, bothP<0.05). But there was no significant difference in the levels of LIF and E2in follicular fluid between two groups (tvalue was 1.305 and 0.680, respectively, bothP>0.05). The level of LIF in follicular fluid was positively correlated with the number of retrieval oocyte, the rate of mature oocyte, cleavage rate, high quality embryo rate and E2(rvalue was 0.285, 0.394, 0.302, 0.387 and 0.476, respectively, allP<0.05), but it was not correlated with fertility rate and P (rvalue was 0.050 and 0.243, respectively, bothP>0.05). There was no obvious correlation between LIF in follicular fluid and LIF in embryo culture media after transferring (r=0.107,P>0.05). The level of LIF in embryo culture media of high quality was significantly higher than poor quality (t=8.334,P<0.05).Conclusion The level of LIF in follicular fluid is correlated with E2and the quality of oocyte, and the quality of oocyte can be assessed according to the level of LIF. The LIF in embryo culture media can be used to predict the quality of embryo and outcomes of IVF-ET.

in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET); leukaemia inhibitory factor (LIF); follicular fluid; embryo culture media

2014-08-22

郝天羽(1963-)，男，主任医师，博士，主要从事不孕症和辅助生殖技术的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.01.011

R711.7

A

1673-5293(2015)01-0027-04