广西扶绥县壮族人群CXCL12基因多态性与肝癌家系遗传易感性的关系▲

何承诚 谢裕安 毛赛南 赵瑞强 闫 雷 黄 正

(广西医科大学1附属肿瘤医院实验研究部，

2生物化学与分子生物学教研室，南宁市 530021，E－mail:jake1976@163．com)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第5大常见癌症，是第三位的癌症死因，全世界每年有75万新发患者，大多数(＞80%)患者发生在撒哈拉沙漠以南的非洲和东亚地区，其中中国就有超过 50%的患者［1］。广西扶绥县是我国肝癌高发区之一，肝癌发病率高达52．79/10 万人年［1－2］。肝癌的发病具有明显的家族聚集倾向，遗传因素在家族聚集性肝癌中具有重要作用［3］。王云等［4］提出轴突导向通路 CXCL12 基因与肝癌的发生发展密切相关。有学者对北京汉族人群进行研究，以最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)＞5%作为标准，认为CXCL12基因rs3780891位点多态性可能与肝癌的遗传易感性有关［5］。还有很多学者的研究也认为CXCL12基因rs3780891位点具有较高研究价值［6－7］。本研究探讨广西扶绥县壮族人群肝癌家系CXCL12基因rs3780891多态性与肝细胞癌遗传易感性的关系。

1 资料与方法

1．1 研究对象 采用对照研究方法，所有研究对象均来自具有相似暴露背景的肝癌高发区的广西扶绥县。肝癌家系组包括20个肝癌家系由肝癌患者及其直系亲属组成，其中肝癌患者20例，直系亲属59例，共79例。肝癌患者为2003年1月至2011年10月在广西医科大学附属肿瘤医院进行外科手术的患者，术后均经病理组织学诊断为HCC，术前未经放射、化学或生物治疗。直系亲属为与肝癌患者有直接血缘关系未患肝癌的一级亲属(包括父母、子女、兄弟姐妹)和二级亲属(包括叔伯、堂兄弟、堂姐妹)。经病史采集显示其直系亲属中至少有1人确诊为肝癌。79例中，男45例，女34例，年龄16～86岁，中位年龄44岁;HbsAg(+)50例，HbsAg(－)29例;AFP(+)14例，AFP(－)65例;吸烟(≥10支/d)17例，不吸烟(＜10支/d)60例，饮酒 64例(≥100 g/d)，不饮酒(＜100 g/d)12例。正常对照组选择在扶绥县医院进行健康体检的人群，与肝癌家系组无血缘关系，体检结果均健康，无肝炎病史、肿瘤病史及遗传病史，共40例，其中男26例，女14例，年龄16～85岁，中位年龄47岁。吸烟15例，不吸烟(＜10支/d)25例，饮酒17例，不饮酒(＜100 g/d)23例。正常对照组与肝癌家系组间年龄、性别比较，差异无统计学意义(P＞0．05)。本研究按照国家人类基因组研究伦理准则进行，所有入选者均签知情同意书。

1．2 主要试剂及仪器 iPLEX反应试剂(批号:0000008607)、384－well SpectroCHIP 生物芯片(批号:0000008596)、HOTSTART Taq 酶(批号:14955500)、SAP酶(批号:0000008616)、纯化树脂均购自Jena Bioscience公司;质谱检测仪和点样仪购自美国Sequenom公司，GeneAmp®PCR System 9700购自美国Invitrogen公司。

1．3 DNA提取 用于分析CXCL12基因型的基因组DNA。采用天根生化科技(北京)有限公司生产的试剂盒，采用血液/细胞/组织DAN提取试剂盒提取。肝癌家系组中的20例肝癌患者取手术切除的癌组织标本提取;肝癌家系组中的59例直系亲属及40例正常对照组均采用静脉血液标本提取，提取DNA置于－20℃冰箱保存备用。

1．4 CXCL12基因型分析 由深圳华大基因公司的SEQUENOM实验平台采用美国SEQUENOM公司MassARRAY时间飞行质谱技术对所有研究对象DNA的SNP的基因分型，采用TYPER4．0软件分析实验结果，获得分型数据。

1．4．1 引物设计及合成:使用Assay Designer 3．1软件设计引物，由深圳华大基因公司合成，每个SNP位点对应2条PCR扩增引物和1条延伸引物，引物序列如下:CXCL12基 因 rs3780891:扩 增 引 物 1－F:5'－CTGGCGATGTGTGTAGAA－3';扩增引物 2－R:5'－CTGGCGATGTGTGTAGAG－3';延伸引物序列:5'－CTGGCGATGTGTGTAGA－3'。

1．4．2 SNP等位基因分析和单个基因型测定:使用热启动Taq酶(Jena Bioscience公司，美国)，在384孔板上常规扩增待测片段(40个循环)，然后在PCR产物中加入2 μl碱性酸化酶(SAP，Sequenom)消化液(双蒸水1．53 μl，HME 缓冲液 0．17 μl，SAP 0．474 U)，以除去未用尽dNTP，消化反应为37℃ 60 min;85℃ 10 min。然后根据Sequenom程序进行引物延伸反应。用纳升点样仪(SpectroCHIP，Sequenom)，在 SpectroTYPER－RT 操作程序中，编辑相对应的引物和样本，并按顺序读取数据［9］。

1．4．3 飞行质谱技术检测 SNP位点:采用 Sequenom MassARRAY平台对 CXCL12基因进行 SNP分型，TYPER4．0软件分析实验结果，获得分型数据。根据引物延伸反应产物质谱峰的位置确定其分子质量，从而得出SNP分型结果;同时根据质谱峰的信噪比、峰尖位置、峰宽度等参数判定高质量 (conservative)、中等质量(moderate)和低质量(agressive)3种分型结果。同一种颜色可以对应2个或3个峰值，分别为SNP位点的延伸引物峰及两个等位基因峰，若该位点属于纯合子，则仅存在1个等位基因峰，若为杂合子，则存在2个等位基因峰［9］。

1．5 统计学分析 采用SPSS 21．0统计软件对数据进行统计学分析。采用拟合优度χ2检验法进行对照组基因型分布的Hardy－Weinberg遗传平衡检验，判断研究对象是否具有人群代表性。用χ2检验和非条件logistic回归分析法计算各种基因型的比值比(OR)及95%可信区间(95%CI)。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 质谱分析 CXCL12基因rs3780891位点存在AA、GA、GG 3种基因型，其中AA基因型2例、GA基因型22例、GG基因型95例。见图1。

图1 CXCL12基因rs3780891位点基因型分型图

2．2 CXCL12基因rs3780891位点基因型吻合度检验

经Hardy－Weinberg遗传平衡定律进行吻合度检验，肝癌家系组、正常对照组人群中CXCL12基因rs3780891位点基因型频率与期望值吻合度较好(χ2=2．160，P=0．140;χ2=0．820，P=0．370)，符合 Hardy－Weinberg 遗传平衡定律，表明具有良好的代表性。见表1。

表1 CXCL12基因rs3780891位点基因型频率吻合度检验

2．3 CXCL12基因rs3780891位点多态性与HCC的关系 正常对照组与肝癌家系肝癌组患者的 CXCL12基因rs3780891位点GA基因型分布频率比较，差异无统计学意义(OR=0．75，95%CI=0．20 ～2．78，P=0．670);肝癌家系中直系亲属组与肝癌组的GA基因型分布频率比较，差异也无统计学意义(OR=1．53，95%CI=0．41 ～5．77，P=0．529)。见表2。达的蛋白［10］。目前有研究表明CXCL12基因多态性对乳腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、口腔癌、结直肠癌等多种癌症有显著易感性［11－15］。CXCL12基因 rs180115位点多态性与肿瘤易感性有关，突变等位基因A携带者增加肿瘤发病风险［16］。Brown 等［7］对CXCL12基因 rs3780891位点与Ⅰ型糖尿病易感性的关系进行了研究。目前尚无CXCL12基因rs3780891位点与肝癌遗传易感性的研究报告，尤其在肝癌家族聚集性方面。

本研究首次探讨CXCL12基因rs3780891位点与广西扶绥县壮族人群肝癌家族的遗传易感性的关系。研究结果发现，正常对照组与肝癌家系肝癌组患者CXCL12基因rs3780891位点GA基因型分布频率差异无统计学意义(P＞0．05);肝癌家系中直系亲属组与肝癌组患者GA基因型的分布频率比较，差异无统计学意义(P＞0．05)。说明CXCL12基因rs3780891位点不是肝癌发生的危险位点。本次研究未发现CXCL12基因rs3780891位点多态性与广西扶绥县壮族肝癌家族的遗传易感性有关联，其中原因可能是收集病例样本量及对照样本量太少。

总之，本研究结果未发现CXCL12基因rs3780891位点多态性与家族聚集性HCC的遗传易感性有关联。这对于进一步研究扶绥县乃至其他地区肝癌高危人群的发病风险提供了分子遗传学依据，并对肝癌的预防具有一定的参考意义。

表2 各组CXCL12基因rs3780891位点的基因型分布及危险度分析(n，%)

3 讨论

肝癌是常见的消化系统肿瘤。有研究表明，HBV/HCV感染、黄曲霉毒 B1(aflatoxin B1，AFB1)摄入、饮水污染、不当的饮食习惯等因素可能是肝癌的危险因素［9］。但暴露于上述危险因素的个体不一定都发生肝癌，这表明遗传易感性的差异对个体肝癌发病有重要作用。CXCL12为基质细胞源性因子－1(stromal cell－derived factor 1，SDF－1)基因3UTR第801位的G突变为A后表

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