Toll样受体与急性胆管炎关系的研究进展

刻浩润 赵洪强 李为民

1.解放军医学院，北京 100853；2.解放军第三〇九医院肝胆外科，北京 100091

Toll样受体与急性胆管炎关系的研究进展

刻浩润1，2赵洪强1，2李为民2▲

1.解放军医学院，北京 100853；2.解放军第三〇九医院肝胆外科，北京 100091

急性胆管炎（AC）是腹部外科中的常见疾患，其严重型（急性重症胆管炎）具有发病凶险，预后不良的特点。胆管存在梗阻的基础上并发肠道菌群易位、滋生是造成AC的最主要致病因素，而造成胆管感染的主要是革兰氏阴性菌，如大肠埃希菌，其毒力主要体现在细菌外膜成分——脂多糖（LPS）上。LPS从细菌外膜释放出来，通过诱导体内单核/巨噬细胞合成并释放多种炎症介质进而参与免疫炎症反应。LPS主要通过Toll样受体（TLR）来发挥致炎效应。近年来有关TLR在AC发病过程中作用的研究得到了进展，为理解AC的免疫病理过程提供了新的线索。

Toll样受体；急性胆管炎；免疫病理

急性胆管炎（acute cholangitis，AC）是腹部外科常见疾患，革兰氏阴性菌外膜成分——脂多糖（LPS）被认为是诱导炎症发生，造成疾病发生、发展的关键因素。随着免疫学和分子生物学技术的发展，作为LPS主要配体的Toll样受体 （Toll like receptor，TLR）在AC发生、发展过程中的作用得到关注。研究提示，TLR 在AC造成肝脏损伤的病理过程中起关键作用，其作用方式可能与其介导的LPS损毁胆管细胞紧密连接的过程有关。明确TLR在AC中的作用可为将来揭示AC的免疫病理提供新的线索。

1 AC是影响人类健康的重要疾病

AC是在胆管梗阻基础上并发的细菌感染。感染往往不仅局限于胆管本身，还能够播散全身，最终对其他脏器造成严重影响，尤其是肝脏。胆总管结石或者存在于胆管的胆囊结石是造成AC的最主要原因［1-2］。由于缺乏大宗病例流行病学调查，据估计世界范围内健康人群中有10%患有胆囊结石［3-4］，有10%～20%的有症状的胆囊结石患者会并发胆总管结石［5-9］，而在这类人群中有0.2%的患者可能出现AC的症状［10］。然而，上述只是从结石的角度去粗略估计AC的发生率，它并不能代表真正的发病率，因为还有其他诱因，例如原发性胆管结石、肿瘤和狭窄等没有被考虑在内。

1877年首次被描述的Charcot三联征——腹痛、发热、黄疸至今仍是临床诊断AC的主要方法。大多数AC患者在应用抗生素后症状会得到缓解，而最终治愈这类疾病往往还需疏通胆管阻塞［11］。尽管大部分患者在接受抗生素和胆管疏通治疗后能够痊愈，但研究显示该疾病病死率仍高达10%［12-13］。

对于胆管形态及功能正常的健康个体来说，胆汁中是没有细菌存在的，然而在病理情况下，细菌则可能通过壶腹（排石、乳头括约肌切开术或支架置入术后）或门脉（菌血症情况下细菌由肝血窦转移至胆管）进入胆管从而感染整个胆管系统［14-19］。对于健康个体来说，由于胆汁流动所起到的冲刷作用以及胆汁中的抗菌成分（胆盐和胆汁IgA），细菌的侵入并不一定意味着AC的发生，而这一情况如果发生在胆管存在梗阻的情况下，AC发生的概率就大大增高了，原因在于梗阻情况下的胆管影响了胆汁的流动和IgA的产生，导致肝巨噬细胞功能以及胆管紧密连接受损，甚至引发胆管静脉反流的发生［16，19-23］。正常的胆管内压力为7～14 cm H2O，而当胆管压力增加至＞20 cm H2O时则能够促使细菌逆行进入循环系统，从而造成全身反应［14］。

造成AC最常见的病原体为革兰氏阴性菌，如大肠埃希菌。严重的AC有可能进一步发展成为脓毒血症、系统性炎症反应综合征，甚至多器官功能障碍。研究认为，诱导AC致命病理过程的最主要因素在于机体免疫细胞对细菌的非适应性反应，而TLR是机体识别细菌毒力成分的主要受体家族之一，被认为在AC发病过程中起关键作用。

2 TLR是介导天然免疫反应的重要受体系统

对TLR的研究最早从果蝇开始。此后，研究不断深入，迄今人们已经发现了9种果蝇TLR（dTLR）和10种人TLR（hTLR），分别被命名为TRLl～10［24］。hTLR是与果蝇Toll蛋白具有同源性的表达于细胞膜上与免疫系统识别微生物有关的一类受体家族，能够识别特定类型微生物的保守的分子成分，即病原体相关分子模式（pathogen-associatedmolecular patterns，PAMPs）。

人类的TLR蛋白属于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜段和胞内区3部分组成，其胞外区由18～31个富含亮氨酸的重复序列和半胱氨酸结构（半胱氨酸残基形成链内二硫键襻）所组成，这种结构可以加强蛋白质之间的黏附，与病原体及其产物的特异性识别有关。胞内段大约为200个氨基酸大小与人白介素-1受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）胞质区结构相似，称为Toll样受体/白介素-l同源结构域（Toll/IL-1-receptor Homo-logous Region，TIR），是TLR和IL-1R向下游传导信号的核心元件［25］。

TLR在淋巴组织和非淋巴组织均有表达，但不同的TLR在不同的组织和细胞表达量有所不同。大多数TLR配体都归类于PAMPs，如细菌DNA中未甲基化的CpG基序和肽聚糖、革兰氏阴性菌的LPS、革兰氏阳性菌的磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）、RNA病毒的dsRNA，许多微生物和寄生虫表面的以Man、ManNAc、GlcNAe、Fuc等为末端糖基的糖结构，支原体、螺旋体的膜脂蛋白、分枝杆菌的糖脂肽、脂阿拉伯甘露糖、酵母菌的甘露聚糖以及病毒的双链DNA［26］。众多研究结果表明，TLR对配体的识别需要其他蛋白的协同作用。CD14是一个在TLR的功能中起关键作用的蛋白质分子。它主要有两个作用：①接受血浆中的LPS结合蛋白（LPS-binding protein，LBP）呈递的、由细菌表面脱落下来的LPS，形成的膜表面的LPS/CD14/ LBP复合物可活化LPS应答细胞；②作为活化信号传导的中介，因CD14缺乏胞内域，为使活化信号得以在胞内继续传递，需要和由另一个协同受体MD2与TLR4所形成的TLR4-MD2复合物相联系。MD2是一种可溶性蛋白分子，通过与TLR4的胞外域结合，活化LPS介导的NF-κB途径，且为LPS依赖的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）活化所必需［27］。TLR主要通过髓样分化因子88依赖性和非髓样分化因子88依赖两条途径最终引发致炎基因表达［28-29］。

3 TLR在AC致病过程中起关键作用

3.1 TLR参与AC致肝脏损伤的病理过程

严重型AC意味着在胆管炎的基础上并发了其他器官的损伤，而肝脏往往是最常见的受损器官之一。在利用大鼠构建的AC模型中，研究人员发现，TLR4在AC致肝脏损伤过程中起关键作用。Yu等［30］在大鼠AC模型中，首先利用病理检测的方法确认了离“病原地”最近的肝脏组织的损伤情况。进一步研究发现，受损的肝脏细胞内TLR4和NF-κB的表达较对照组相比呈显著升高趋势，且无论在基因还是在蛋白水平，TLR4在大鼠AC模型构建1 h后即开始升高。在术后6 h观测到表达的高峰。进而还发现，TLR4表达的变化水平与肝脏细胞NF-κB和血清中TNF-α变化水平保持一致，因而，研究者认为在大鼠AC模型中，肝脏细胞TLR4高表达与其损伤密切相关，TLR4通过激活NF-κB和释放促因子如TNF-α来发挥其致病效应。

如前所述，MD-2在TLR和LPS之间起桥接作用，在TLR介导LPS信号转导过程中起关键作用。2004年，Ohta等［31］利用RT-PCR技术扩增出了一种MD-2的剪接体——MD-2B。研究显示，MD-2B能够以剂量依赖性阻断TLR4/MD-2/LPS介导的NF-κB信号转导过程。进而，Miao等［32］在AC大鼠模型中观察到了MD-2、MD2B在疾病过程中的作用。研究发现，肝脏TLR4和MD-2mRNA表达水平在AC大鼠模型建立的6、12、24、48、72 h间逐渐上调，而MD-2B mRNA水平则呈下降趋势。在对AC大鼠应用TLR4抑制剂后，TLR4、MD-2 mRNA表达与AC对照组相比显著下降，而MD-2B则表达上调。MD-2BmRNA表达水平与MD-2、TLR4mRNA水平呈负相关。笔者认为，在大鼠AC模型中，MD-2在TLR4介导的肝脏损伤中起重要作用，而MD-2B则作为负向调控蛋白而存在。

3.2 TLR介导了LPS损毁胆管细胞紧密连接的过程

正常的胆管上皮细胞构成一道屏障，防止胆汁逆流进入肝脏实质。胆管上皮细胞间的紧密连接是构成这一屏障的重要结构。病理情况下，紧密连接的结构和功能受到影响，造成胆汁成分逆流，进而引发肝脏甚至系统性炎症反应［33］。研究发现，LPS具有毁损紧密连接的作用，而这一作用是通过TLR4介导的。紧密连接由多种特殊蛋白分子组合而成，如闭锁蛋白（Occludin），紧密连接蛋白（Zonula occludens，ZO），闭合蛋白（Claudins）以及连接黏附分子（junctional adhesionmolecule）等［34］。紧密连接蛋白分子与周围肌动球蛋白环相互作用。此外，一系列胞内信号分子，如c-Src、磷脂酰肌醇3激酶、ERK、PKCζ以及PP2A在紧密连接富集［35-36］。大量证据显示，紧密连接以及细胞旁通透性受诸如胞内钙离子、环磷酸腺苷、GTP酶转换蛋白、蛋白激酶等多种信号分子的调控［37-38］。Sheth等［39］研究发现，LPS能够以时间和剂量依赖的特性去影响胆管单层细胞模型的屏障功能和细胞旁通透性。LPS能够诱导细胞间连接处的紧密连接蛋白，闭锁蛋白等的再分布，减少ZO-1的表达水平。在酪氨酸激酶抑制剂的作用下上述效应显著减轻，研究发现其效应体现在抑制了LPS诱导闭锁蛋白去磷酸化作用，进而通过siRNA技术沉默c-Src、TLR4或LBP的表达均能减弱LPS诱导的紧密连接功能下降的现象。ML-7是一种肌球蛋白轻链激酶抑制剂，也被证实能够减弱LPS诱导细胞旁通透性的增加的现象。笔者认为，LPS的存在能够显著影响紧密连接的功能，而这一效应是通过c-Src、TLR4、LBP和肌球蛋白轻链激酶依赖的机制诱导的。

综上所述，目前研究已明确揭示TLR在AC炎症的发生、发展过程中扮演了重要角色。TLR是机体启动天然免疫系统从而应对感染的重要成分，明确其在AC中的作用可为将来揭示AC的免疫病理提供新的线索。将来围绕天然和获得性细胞免疫系统进行研究，我们将获得更多的有关AC免疫机制的知识和规律，进而为研究调控AC免疫，防治重症AC发生提供线索和方向。

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Research Progress of the relationshiP between Toll like recePtor and acute cholangitis

LIU Hao-run1，2ZHAO Hong-qiang1，2LIWei-min2▲
1.Medical College of PLA，Beijing 100853，China；2.Department of Hepatobiliary Surgery，the 309thHospital of PLA，Beijing 100091，China

Acute cholangitis（AC）is a common disease of abdominal surgery with features of dangerous and poor prognosis for its severe type（acute severe cholangitis）.Themain factor causing AC is believed to be the intestinal flora shift and breeding on the basis of biliary obstruction.Biliary tract infection ismainly caused by Gram negative bacteria，such as Escherichia coli，and its toxicity ismainly reflected in the bacterial outermembrane component（lipopolysaccharide，LPS）.LPS released form bacterial outermembrane participates in immune and inflammatory reaction through inducing the synthesis and releasing various inflammatory mediators of mononuclear macrophage in vivo monocytes/ macrophages.LPSmainly through Toll like receptor （TLR）to play the inflammatory effect.In recent years，research on the effect of TLR in the pathogenesis of AC had gain developmentwhich provides us new clue for the understanding of the immune pathological process of AC.

Toll like receptors；Acute cholangitis；Immune pathogenesis

R575.6+1

A

1674-4721（2015）02（c）-0013-04

2014-12-03本文编辑：许俊琴）

▲通讯作者