基因芯片技术在临床微生物检验中的应用和优势

汤桂丽

（中国人民解放军广州军区武汉总医院，湖北 武汉 430010）

基因芯片技术在临床微生物检验中的应用和优势

汤桂丽

（中国人民解放军广州军区武汉总医院，湖北 武汉 430010）

基因芯片技术作为一种前沿生物技术，具有灵敏、快速、高通量的优点，在医学的各个领域和临床微生物检验中都有广泛的应用。该文就基因芯片技术在临床微生物检验中的应用和优势进行了简要综述。

基因芯片技术；临床微生物；应用；优势

基因芯片技术(gene chip technology，GCT)可以准确、快速、及时地诊断感染性疾病的病原体[1-2]，对患者感染性疾病的临床治疗、预后具有重要价值[3-5]。传统的抗体检测法(antibody detection method)、病原体培养法(pathogen culture method)等，操作烦琐且所需周期较长[6-7]，GCT的出现和成熟为临床微生物的检验提供了有力的技术条件。现就GCT在临床微生物检验中的应用和优势进行了简要的综述。

1 应用背景及现状

GCT是在20世纪80年代随着“人类基因组计划”的发展，90年代中期兴起的一种新技术，可超高通量检测基因表达[8]。其主要原理是将寡核苷酸探针或DNA以一定的顺序和密度固定在载体(如硅片、玻片、NC膜、塑料片等)上，与核酸分子(用荧光染料或放射性核素标记)进行杂交，通过对杂交信号检测、分析，获得样品中大量的基因表达信息。GCT具有信息量大、快速、可进行高通量筛选以及数据一致性好等优势[9]。目前，GCT已在生命科学的多个领域中显示其发展潜力，并为临床微生物检验提供了良好的发展前景，已广泛应用于临床微生物的基因组、基因变异性、基因多态性分析以及致病机制、感染后宿主机体基因表达的变化等方面的研究[10]。GCT的日趋完善，使临床微生物检验和抗生素敏感性测试可同步进行，将使临床微生物检验更上一个台阶。

2 细菌检测

2．1 分析临床微生物基因组、基因变异性及多态性

基因芯片检验病原菌的原理基于细菌的16S rRNA基因的高度保守性[11]。rRNA被称为细菌的“活化石”，原因是该基因高度保守且进化速度缓慢，可作为细菌生命的标志[12]。rRNA基因包括23S(长3．3kb)、16S(长1．6kb)和5S(仅长0．12kb)3个基因。目前，最常选用16S rRNA作细菌的分类和鉴定的基因，主要原因是16S rRNA基因长度适中[13]，可作为细菌分类“金指标”。16S rRNA基因与真核生物明显不同的高度保守序列不少于9个[14]，为细菌所共有，目前基因库几乎包含所有已知细菌的16S rRNA基因的碱基序列。根据RNA易降解的特点，多采用检测16S rRNA对应染色体上的16S rDNA碱基序列序列，16S rDNA内部结构分为可变区与保守区(为细菌所共有，存在9～10个变异区(V1～V10)两部分，两部分交错排列，不同种属间会有一定差异。对同一种细菌其基因组的同源性应不小于70%，而对于16S rDNA，不同种属的判定标准为差异在3个碱基以上，可用于细菌的分类和鉴别[15]。Han Bingbing等[16]采用GCT对4种细菌(大肠杆菌、伤寒杆菌、空肠弯曲菌、痢疾杆菌)进行鉴别诊断，在设计这种鉴别诊断芯片时，以两种靶基因(一是各菌种间的差异序列，二是同种细菌不同血清型所特有的标志基因)固着于芯片表面，同时还含有细菌所共有的16S rDNA保守序列以确定为细菌感染的标志。与传统方法相比，该方法敏感度高、操作简单、诊断效率高、重复性好且节省时间[16]。

2．2 检测细菌耐药基因

为了避免临床无指征滥用抗菌药物，需准确及时地检测病原菌的耐药性，这样可有效预防耐药菌(drug-resistant bacteria，DRB)以及多重耐药菌的产生[17-18]。传统主要依靠培养法对细菌耐药性进行检测，普通细菌约需2 d可出结果，而对于生长速度极慢的结核杆菌(N／med tuberculosis bacilli，NTB)则需3～4周时间。国外研究人员采用GCT检测耐药基因[19]，如Michael Wilson就曾使用此方法检测到NTB中脂肪酸合成酶Ⅱ(Fatty acid synthaseⅡ，FACⅡ)，efpA，fbpC，fadE23，fadE24及ahpC基因的改变与细菌耐药性有关。美国（NARC）利用研制出的基因芯片来检测NTB对利福平(rifampicin)、乙胺丁醇(ethambutol)及异烟肼(isoniazid)的耐药性，检出率分别为75%，70%及50%。采用GCT可同时检测耐药菌的多个耐药基因，也可同时检测多个耐药菌的多个耐药基因[20]。找到耐药菌的耐药基因，不仅可将耐药菌分成不同的亚型以便在临床使用相应的抗菌药物，还可通过研究与药物相对应的特殊靶向基因，寻找能够预测个体对药物敏感性的基因，对新型抗菌药物的设计也有帮助，可以制订出个人药物敏感谱，对临床用药以及新药的合成均起指导作用，进而改善治疗效果。

3 病毒检测

3．1 快速诊断流感病毒

对流感病毒(flu virus，FV)基因组的研究发现，其病毒膜蛋白M1由其RNA第7节段编码，甲型FV M基因编码252个氨基酸的M1蛋白，乙型FV M基因编码248个氨基酸的M1蛋白，均非常保守，且两型病毒M1蛋白间只有63个氨基酸相同，型特异性明显，故M基因即可以诊断FV并对其分型，又不受抗原变异以及漂移的影响，可长期使用，是流感病毒分子诊断的基础[21]。

3．2 检测肝炎病毒及其致病性相关研究

基因芯片可对肝炎病毒(hepatitis virus，HV)的分型、变异、突变及病毒核酸含量进行高通量、平行检测。临床对献血员的丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)筛查主要是通过检测血中的HCV抗体、HBV抗原和抗体，而利用基因芯片将HCV及HBV的特异性基因片断固着于芯片上，可直接对血液中两种Virus的病原体同时进行检测，为了提高检测效率也可将多种荧光标记样本同时杂交于1张芯片上[22]。目前，在肝炎的抗病毒治疗中产生的病毒耐药突变，最典型者为拉米夫定(3TC)抗HBV治疗中出现的YMDD变异。

3．3 检测人类免疫缺陷病毒及感染后宿主机体基因的表达

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的检测方法目前最常用的是血清学 HIV抗体检测，以 gpl60／gpl20，gp41，p31和p24这4种抗体均为阳性作为确诊HIV感染的诊断标准[1]。基因芯片将链扩增技术(PCR)与核酸分子杂交完美结合，通过对HIV基因组分析，将该病毒的高度保守序列作为鉴定指标，可以直接对病毒病原体进行检测，在抗体产生之前即可作出早期诊断。

4 性传播疾病检测

基因芯片利用核酸分子碱基互补配对原理，将多种病原体特异基因序列(探针)提取后以微阵列方式固定于芯片上[23]，使其与标记的样品核酸分子杂交，通过检测杂交信号强度，获取样品核酸分子的数量和序列信息，从而针对一份生物样品，可同时检测多种性传播疾病的病原微生物。利用GCT检测性传播疾病的病原体相对目前被广泛应用的ELSA及PCR检测技术，具有特异性、灵敏度高，假阳性率和假阴性率低，操作快速、简便，自动化程度高、结果客观性强等优点，弥补了传统技术的不足，如ELSA可能出现交叉免疫现象，PCR技术时常发生假阳性或假阴性，从而避免了误诊现象的发生。诊断的病原体主要有梅毒、生殖器疱疹、淋病、巨细胞病毒感染症、尖锐湿疣、非淋菌性阴道炎、外阴阴道白色念珠菌病等多种性传播疾病[24]。

5 前景

近年来，GCT的应用前景非常广阔，但在技术和应用上仍存在很多需要解决的问题。首先，由于探针的杂交有一定的错配率，从而产生一定的背景。如何区分这种背景所造成的假阳性和由于标本中病原体拷贝数太低所造成的弱阳性，是临床微生物芯片面临的主要挑战。对临床微生物来说，多数都是原核生物，其共同特点是没有polyA尾，因此无法像真核生物那样通过polyA尾纯化mRNA，并用反转录方法建立cDNA文库。因此，如何方便、快捷地建立病原微生物的检测探针是基因芯片亟待解决的瓶颈。其次，样品的处理和应用也面临着很多干扰因素，对于常规病原微生物检测芯片的应用，需要提高芯片诊断的灵敏度和特异性。如何正确地对样品进行简单的处理，使混杂因素降到最低，是日常工作者面临的问题。特别是蛋白质芯片技术发展缓慢，如何使各种蛋白质稳定地固定于芯片载体上，如何保持点样蛋白的天然构象和生物学活性等问题，尚有待进一步解决。尽管存在一定的不足和缺憾，GCT与传统微生物的检测方法相比，仍具有检测系统微型化、对样品的需要量非常少、检测效率高、能同时分析多种基因组或诊断用DNA序列的优势，同时还能检测宿主细胞基因组的转录情况，有助于揭示发病机制及感染性疾病的诊断和治疗，因此具有广阔的应用前景。

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Application and Advantage of Gene Chip Technology in Clinical Microbiological Detection

Tang Guili
(Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Region,Wuhan,Hubei,China 430010)

The gene chip technology as a kind of frontier biotechnology has the advantages of sensitivity,rapidness and high throughput, and has a wide range of applications in various fields of medicine and clinical microbiological detections．The application and superiority of the gene chip technology in the clinical microbiological detection are briefly reviewed．

gene chip technology;clinical microbiology;application;advantage

R446.61

A

1006-4931(2015)05-0092-03

2014-09-11)