低糖对星形胶质细胞水通道蛋白4表达及分布的影响

邓江山 赵飞 俞晓燕 赵玉武

低糖对星形胶质细胞水通道蛋白4表达及分布的影响

邓江山 赵飞 俞晓燕 赵玉武

目的 探讨低糖体外培养对大鼠原代星形胶质细胞水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)表达量及分布的影响。方法 对体外培养的原代大鼠星形胶质细胞进行0 mmol/L(无糖)和1 mmol/L葡萄糖低糖培养，以5.5 mmol/L葡萄糖作为正常糖浓度对照进行如下实验：(1)采用活细胞成像技术检测无糖培养后的星形胶质细胞的体积变化；(2)以Western blot检测无糖培养0 h、3 h、6 h、12 h和24 h，以及0 mmol/L、1 mmol/L和5.5 mmol/L葡萄糖培养24 h后星形胶质细胞的AQP4表达量；(3)以免疫荧光染色检测0 mmol/L、1 mmol/L和5.5 mmol/L葡萄糖培养6 h后AQP4在星形胶质细胞上的分布。结果 (1)与0 min时比较，无糖培养15 min(1.14±0.03)和30 min时(1.15±0.02)星形胶质细胞相对体积均明显增大(P<0.01)。(2)无糖0 mmol/L(含血清)培养实验中，与0 h(AQP4相对表达量为1)比较， 12 h(1.55±0.21)、24 h时(1.67±0.16)AQP4相对表达量均明显增加(P<0.01)；0 mmol/L、1 mmol/L和5.5 mmol/L葡萄糖(含血清)培养24 h后，与5.5 mmol/L组(AQP4相对表达量为1)比较，0 mmol/L组AQP4相对表达量(3.23±0.23)明显增加(P<0.01)。(3)与0 h时(AQP4相对表达量为1)比较，无糖(无血清)培养6 h后AQP4蛋白相对表达量(1.32±0.09)明显上调(P<0.05)，24 h时相对表达量(0.80±0.05)下降(P<0.05)；0 mmol/L、1 mmol/L和5.5 mmol/L葡萄糖(无血清)培养24 h后，与5.5 mmol/L(AQP4相对表达量为1)组比较，0 mmol/L组 AQP4相对表达量(0.75±0.07)明显降低(P<0.05)。无论含或不含血清，与5.5 mmol/L葡萄糖组比较，0 mmol/L和1 mmol/L组AQP4在星形胶质细胞向膜上集中特异性分布更加明显。结论 低糖处理可引起星形胶质细胞水肿，AQP4蛋白表达量发生变化和向细胞膜上集中分布。AQP4在低血糖性脑水肿中可能发挥重要作用。

水通道蛋白4；低血糖；星形胶质细胞；脑水肿

低血糖为糖尿病患者强化血糖控制的常见并发症。由于糖尿病患者自主神经调节障碍，“未察觉低血糖”的反复发生更容易引起严重低血糖的发生[1]。低血糖较高血糖具有更迅速、直接且严重的危害。葡萄糖是脑细胞惟一能量来源，葡萄糖供应中断迅速导致脑功能障碍，轻者易激惹、谵妄，重者昏迷、癫痫发作，甚至死亡。既往动物实验研究表明，低血糖可导致脑水肿[2]。

水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)为脑内存在的主要水通道蛋白家族成员之一，在脑水肿的相关研究中占有重要地位。AQP4主要存在于星形胶质细胞足突上，对水双向通透，其开放或关闭直接影响水向细胞内、外的移动速度。研究表明，AQP4与脑缺血[3]、脑出血[4]、脑外伤[5]、低钠血症[6]及肝性脑病[7]导致的脑水肿均相关。AQP4在低血糖性脑水肿中是否也发挥重要作用，目前尚未报道。本研究旨在观察体外低糖培养时星形胶质细胞体积及AQP4表达和定位的变化，以初步阐释AQP4与低血糖性脑水肿之间的关系。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及器材 DMEM培养基及亲脂性膜染料CellMaskTM-Deep red(Invitrogen公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；共聚焦细胞培养皿(NEST生物公司)；RIPA裂解液和BCA蛋白定量试剂盒及4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；碧云天生物技术研究所)；鼠胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)多克隆抗体(Sigma公司)；兔AQP4多克隆抗体(圣克鲁斯生物技术有限公司)；FITC488标记羊抗兔和DyLight 594标记羊抗鼠二抗(杭州联科生物技术有限公司)；24孔细胞专用爬片(上海蔚宏生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 星形胶质细胞分离、培养及鉴定：依据文献[8]，将分离得到的混合胶质细胞培养于DMEM (终浓度葡萄糖25 mmol/L)添加10%(体积分数)胎牛血清和1%(体积分数)青/链霉素的完全培养基中，每3 d换液1次，培养至第9天细胞汇合后水平摇床200 r/min摇20 h分离少突胶质细胞和小胶质细胞。将贴壁的星形胶质细胞用胰酶消化下来后继续培养，3～4周后经GFAP 染色鉴定，星形胶质细胞纯度达到95%左右，可用于后续实验。后续实验所用细胞采用同样方法分离、纯化和培养，均为上述培养时间内的大鼠原代星形胶质细胞。

1.2.2 无糖处理后细胞体积检测：依据文献[9]，采用活细胞工作站成像技术检测细胞体积的变化。将细胞种植于共聚焦细胞培养皿，24 h 后吸去原培养基，加入含有CellMaskTM-Deep red(终浓度1 μg/mL，以无糖DMEM稀释)的培养基1 mL于37℃孵育5 min，吸去培养基，无糖DMEM洗2次后迅速换加新鲜的无糖DMEM置于37℃、5%(体积分数)CO2共聚焦活细胞工作站上沿细胞Z轴方向按照1 μm间距逐层扫描，得到从细胞最高点到最低点的系列层扫图片。对同一细胞分别于换成含无糖DMEM后0 min、15 min、30 min各扫描1次，每个时间点同时选取5个细胞进行拍摄，所得层扫图片利用Imaris图像处理软件进行三维重建，分别计算上述各时间点5个细胞体积的平均值，将0 min时细胞的平均体积作为1，15 min和30 min的细胞平均体积与0 min时比较，分别计算相对体积。

1.2.3 低糖处理后AQP4蛋白表达量检测：将上述分离、纯化并培养至3～4周的星形胶质细胞，用DMEM(终浓度葡萄糖5.5 mmol/L)添加10%(体积分数)胎牛血清和1%(体积分数)青/链霉素的完全培养基中种于6孔板，贴壁24 h。吸去原培养基后分两组实验：(1)无糖DMEM洗2次后加无糖DMEM培养0 h、3 h、6 h、12 h和24 h，每个时间点设加血清或不加血清两组，以0 h组AQP4表达量为1，计算3 h、6 h、12 h和24 h 时AQP4相对表达量；(2)无糖DMEM洗2次后分别加葡萄糖终浓度为0、1和5.5 mmol/L的DMEM培养基培养24 h，每个浓度设加血清或不加血清两组，以5.5 mmol/L组AQP4表达量作为1，分别计算0 mmol/L和1 mmol/L组AQP4相对表达量。

以Western blot法检测AQP4蛋白表达量：收集上述各时间点细胞加入RIPA细胞裂解液冰上裂解30 min，经10 000g离心5 min，吸取部分上清进行BCA法蛋白定量，其余加入上样缓冲液95℃煮5 min后，每孔上样20 μg，经10%(质量分数)SDS-PAGE电泳分离，300 mA、45 min转移蛋白至硝酸纤维素膜上，5%(质量浓度)脱脂奶粉室温封闭1 h，孵育一抗AQP4(1∶400稀释)4 ℃过夜。TBST洗膜后室温孵育荧光二抗(1∶20000稀释)1 h，洗膜后直接用Odyssey(LI-COR)红外荧光扫描仪成像，得到的图片利用Quantity One软件计算灰度值。以β-actin作为内参，计算相应组别AQP4条带灰度值与β-actin灰度值的比值，计为AQP4表达量。

1.2.4 低糖处理后AQP4分布的检测：细胞用DMEM(终浓度葡萄糖5.5 mmol/L)添加10%(体积分数)胎牛血清和1%(体积分数)青/链霉素的完全培养基种于24孔板专用细胞爬片上，贴壁24 h。吸去原培养基，无糖DMEM洗2次后加葡萄糖终浓度为0 mmol/L、1 mmol/L和5.5 mmol/L的DMEM培养6 h，分别设加血清或不加血清两组，以5.5 mmol/L作对照。另设一不换液孔为非处理细胞对照(非处理组)。

以免疫荧光染色检测AQP4在细胞上的分布：24孔板中细胞于换液后6 h时弃培养基，PBS缓冲液洗1次后，4%(质量浓度)多聚甲醛固定15 min，0.2%(体积分数)Triton X-100通透10 min，5%(体积分数)山羊血清封闭1 h，室温孵育AQP4(1∶200稀释)和鼠GFAP(1∶200稀释)一抗混合物2 h，经PBS洗后室温孵育FITC488标记的山羊抗兔(1∶1000稀释；染成绿色)和DyLight 594标记的山羊抗鼠(1∶1000稀释；染成红色)二抗混合物1 h。以DAPI(1 μg/mL)染核5 min，洗膜后用抗荧光淬灭剂封片，指甲油固定，随后采用共聚焦显微镜观察拍照。主要观察星形胶质细胞的形态变化及AQP4在星形胶质细胞上的分布。DAPI将所有细胞核染成蓝色。根据胞浆被GFAP染色染成红色确定为星形胶质细胞，可观察其大致细胞形态。根据AQP4蛋白与绿色荧光标记物结合可发出绿色荧光，可观察AQP4蛋白在细胞上的分布。共聚焦显微镜自带软件将DAPI、GFAP和AQP4合成Merge图片，以细胞核定位，可判断AQP4在细胞胞质或细胞膜上分布的相对位置。

1.3 统计学处理 细胞相对体积及蛋白表达量相对比值以均数±标准差表示。数据采用GraphPad Prism 5软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)分析，各处理组与对照组均数之间的检验采用Dunnett’s法检验。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 无糖处理后细胞体积变化 0 min时细胞扁平，15 min时细胞形态发生变化，表现为表面许多突起和增高。15 min时细胞相对体积(1.14±0.03)比0 min时明显增加(q=10.63，P<0.01)；30 min时细胞相对体积(1.15±0.02)比0 min时也明显增加达15%(q=11.39，P<0.001)。

2.2 低糖处理后AQP4蛋白表达量 (1)无糖培养不同时间组别中，与0 h时比较，含血清培养3 h和6 h时的AQP4蛋白表达量均无明显增加(均P> 0.05)，12 h时和24 h时AQP4蛋白表达量均明显增高(均P<0.01)(表1)。与0 h时比较，无血清培养6 h时AQP4的蛋白表达量明显升高(P<0.05)，24 h时明显降低(P<0.05)，3 h和12 h时均差异无统计学意义(均P> 0.05)(表1)；(2)不同葡萄糖浓度培养24 h后，含血清培养各组，与5.5 mmol/L组(AQP4相对表达量为1)比较，0 mmol/L组AQP4表达量明显升高(3.23±0.23，q=22.24，P<0.01)，1 mmol/L 组差异无统计学意义(1.20±0.15，q=1.995，P>0.05)；无血清培养各组，与5.5 mmol/L组(AQP4相对表达量为1)比较，0 mmol/L组AQP4表达量明显降低(0.75±0.07，q=7.426，P<0.05)，1 mmol/L 组差异无统计学意义(1.06±0.06，q=1.782，P> 0.05)。

注：与0 h时比较，*P<0.05，**P<0.01

2.3 低糖处理后AQP4的分布 非处理组星形胶质细胞体积较大，呈不规则多边形，AQP4弥散均匀分布于细胞上。含血清培养各组，5.5 mmol/L组的细胞形态与非处理细胞相似，AQP4均匀分布在细胞上面；0 mmol/L组和1 mmol/L组中AQP4在膜上较5.5 mmol/L组呈更加明显点状簇集分布(图1)。不含血清培养各组，5.5 mmol/L组本身与非处理细胞形态相同，呈块状，AQP4在细胞上均匀分布，0 mmol/L组和1 mmol/L组的细胞较5.5 mmol/L组均从比较平坦的多边形变为具有更多的纤细突起状，AQP4均表现为从胞内向膜上转移性分布(图2)。

DAPI：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚；GFAP：胶质细胞纤维酸性蛋白；AQP4：水通道蛋白4；Merge：DAPI、GFAP和AQP4合成图片

图1 不同浓度低糖(含10%胎牛血清)培养6 h后AQP4在星形胶质细胞上的分布(共聚焦显微镜×400)

DAPI：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚；GFAP：胶质细胞纤维酸性蛋白；AQP4：水通道蛋白4；Merge：DAPI、GFAP和AQP4合成图片

图2 不同浓度低糖(不含胎牛血清)培养6 h后AQP4在星形胶质细胞上的分布(共聚焦显微镜×400)

3 讨论

葡萄糖为脑组织主要能量来源，中度低血糖即可导致神经细胞电活动异常，表现为脑电图慢波增加。当血糖下降到2 mmol/L时，脑内葡萄糖水平几乎为零[10]。细胞内外的水、离子平衡依赖细胞膜上Na+-K+-ATP主动排出细胞内的Na+以及其他阳离子进行离子交换来维持。在低血糖昏迷早期脑内ATP水平明显下降[10]，能量中断即可引起离子泵功能紊乱，导致离子、水平衡被打乱。动物实验也证明了低血糖性脑水肿的发生，当低血糖引起脑电图成等电位10 min后即可观察到神经元树突肿胀，30 min后出现明显神经细胞线粒体肿胀及细胞膜破裂[10]。Gisselsson等[2]也在低血糖昏迷大鼠模型上证实了广泛性脑水肿的发生。星形胶质细胞在脑内数量是神经元的5倍，其足突作为血-脑脊液屏障重要组成部分紧邻脑微血管，同时具有缓冲细胞外K+及谷氨酸的功能，细胞内渗透压极易升高，从而成为脑水肿更易累及的对象。本研究发现星形胶质细胞在无糖培养15 min时细胞体积增加约15%左右，表明体外星形胶质细胞在无糖培养后迅速发生水肿，体积明显增大，考虑其机制为细胞能量供给完全中断导致水平衡机制紊乱，从而迅速发生细胞性水肿。

AQP4在星形胶质细胞足突上就像“闸门”一样，其表达量高低及是否在膜上准确定位决定了细胞膜快速通透水的效率[11]。本实验中观察到，AQP4表达量在无糖培养后，含血清时逐渐增加，24 h达到高峰，而不含血清时在6 h即迅速明显增加。在1 mmol/L葡萄糖低糖培养时，AQP4表达量无明显变化，以上提示无糖培养造成能量供应完全中断的极端情况能上调AQP4的表达，而含少量葡萄糖(1mmol/L)培养仍能提供少量能量来源不足以引起明显AQP4表达量变化；低糖(0 mmol/L和1 mmol/L葡萄糖)培养6 h后，不管有无添加血清，AQP4均表现出明显向细胞膜上聚集分布。以上共同说明葡萄糖缺乏时造成细胞能量不足，首先导致AQP4在细胞上定位发生变化；若缺乏程度加重、时间延长，则进一步引起AQP4的表达量上调，通过定位及表达量的变化均能促进其发挥转移水的功能。在无血清时，除了AQP4的分布向膜上集中，细胞形态也突起增多，变成纤细状，可能因为无血清造成细胞生长因子缺乏，导致细胞停止生长，发生分化样改变。

本研究结果显示，星形胶质细胞在无糖培养15 min时即发生明显体积增大，而在30 min时未见明显继续增大，提示细胞在能量供应完全中断后，水肿发生较快且迅速达到顶峰；AQP4表达量在无糖处理6 h时才明显增加，明显晚于细胞水肿的发生，间接提示AQP4表达量的变化是细胞发生水肿后促进水快速转移的一种自身反应机制，而非引起快速细胞水肿的原因。本实验中缺糖时AQP4向膜上转移性集中分布和表达量升高均发生在细胞水肿之后，提示AQP4可能在低血糖性脑水肿中发挥保护作用。

本实验在体外证实了缺糖引起星形胶质细胞水肿及AQP4表达量的变化，间接提示AQP4与低血糖性星形胶质细胞水肿有关，但其确切机制有待进一步研究。

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(本文编辑：邹晨双)

Expression and distribution of AQP4 on astrocytes after glucose deprivation

DENGJiangshan,ZHAOFei,YUXiaoyan,ZHAOYuwu*.

*DepartmentofNeurology,ShanghaiJiaoTongUniversityAffiliatedSixthPeople’sHospital,Shanghai200233,China

ZHAO Yuwu Email:zhaoyuwu2005@126.com

Objective To study the effect of glucose deficient media on the expression and distribution of aquaporin 4(AQP4) in the cultured rat primary astrocytes. Methods (1)Primary astrocytes were treated with glucose deficient media(0 mmol/L and 1 mmol/L) and the control media contained 5.5 mmol/L glucose. (2) The cell volume of astrocytes cultured in 0 mmol/L glucose deficient media was measured using live cell imaging technique. The expression of AQP4 was evaluated after 0 h, 3 h, 6 h, 12 h and 24 h of culture in media with 0 mmol/L glucose or after 24 h of incubation with media containing different concentration of glucose(0 mmol/L，1 mmol/L and 5.5 mmol/L) by western blot. Distribution of AQP4 on astrocytes cultured in media containing different concentration of glucose(0 mmol/L，1 mmol/L and 5.5 mmol/L) for 6 h was detected by immunofluorescence staining. Results The relative fold of cells volume cultured in media with 0 mmol/L glucose were (1.14±0.03) and (1.15±0.02) at 15 min and 30 min respectively, there was a significant increase of the volume compared with that at 0 min (P<0.01). In the media containing 0 mmol/L glucose (with serum), the relative fold of protein expression of AQP4 were (1.55±0.21) after 12 h and (1.67±0.16) after 24 h compared to that at 0 h (the relative expression amount of AQP4 was 1,P<0.01). No significant changes were found after 3 h and 6 h. After being cultured in media with different concentration of glucose (with serum) for 24 h, the relative fold of AQP4 expression were (3.23±0.23) in the 0 mmol/L group (P<0.01)and (1.2±0.15) in the 1 mmol/L group(P>0.05) compared with that in the 5.5 mmol/L group(The relative expression amount of AQP4 was 1). In the media containing 0 mmol/L glucose (The relative expression amount of AQP4 was 1, without serum), the relative fold of protein expression of AQP4 was (1.32±0.09) after 6 h, there was significant increase compared with that at 0 h (P<0.05), and (0.80±0.05) after 24 h, a significant decrease was observed comparing with that at 0 h (P<0.05). No significant changes were found after 3 h and 12 h. After being cultured in serum free media with different concentration of glucose for 24 h, the relative fold of expression of AQP4 were (0.75±0.07) in the 0 mmol/L group, there was significant decrease compared with that in the 5.5 mmol/L group(The relative expression amount of AQP4 was 1,P<0.05)and (1.06±0.06) in the 1 mmol/L group, no significant decrease was observed comparing with that in the 5.5 mmol/L group(The relative expression amount of AQP4 was 1,P>0.05). Selective staining of AQP4 on the plasma membrane was detected after 6 h cultured in glucose deficient media (glucose: 0 mmol/L and 1 mmol/L) with or without serum, but not in the control media(glucose: 5.5 mmol/L). Conclusions Glucose deficiency induced cell edema in cultured rat primary astrocytes. Changes of AQP4 expression and the tendency of membrane-targeted distribution may be associated with hypoglycemic brain edema.

aquaporin 4；hypoglycemia；astrocyte; brain edema

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.009

国家自然科学基金资助项目(NO.31271125)

200233 上海交通大学附属第六人民医院神经内科

赵玉武，Email：zhaoyuwu2005@126.com

R741.02

A

1006-2963 (2015)04-0263-06

2014-10-21)