骨形态发生蛋白4在Aβ诱导的神经毒性病变中的表达变化

安娜 孙琳

骨形态发生蛋白4在Aβ诱导的神经毒性病变中的表达变化

安娜 孙琳

目的 探讨骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)在β淀粉蛋白(amyloid β，Aβ)诱导的神经毒性病变中的变化。方法 SD大鼠海马神经元原代培养，经过不同浓度(10、15、20 μmol/L)Aβ25-35毒性片段处理后，通过定量PCR技术检测BMP4 mRNA表达水平。SD大鼠双侧基底前脑注射Aβ1-40建立大鼠痴呆模型，通过免疫组化及免疫印迹检测基底前脑及海马区BMP4蛋白表达水平。结果 Aβ25-35处理组海马神经元内BMP4 mRNA表达较空白对照组明显减少(P<0.05)。免疫组化和免疫印迹实验结果显示，与对照组比较，Aβ1-40注射组大鼠基底前脑区BMP4蛋白表达减少，海马区其表达升高(P<0.05)。结论 Aβ直接下调神经元内BMP4转录及表达，不同脑区内BMP4蛋白可能存在负反馈调节作用。

阿尔茨海默病；骨形态发生蛋白质类；淀粉样β蛋白

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种进展性神经变性疾病，在老年期痴呆中发病率最高[1]。AD主要病理特征为β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)形成老年斑沉积和异常细胞骨架形成神经原纤维缠结[2]。Aβ具有强神经毒性，在导致大量神经元变性和坏死之前可先引起神经突触损伤，进而可引起认知功能障碍[3]。骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic proteins 4，BMP4)是β转化生长因子超级家族中的一员，依据序列种类被分为Decapentaplegic(dpp)亚群[4]。BMP最初是作为软骨内骨形成的诱导剂和骨代谢的调节剂，广泛应用于开放性胫骨骨折、骨不联合及脊柱融合术的治疗。近年发现，其在成熟期神经系统中具有保护作用[5-6]，而BMP在AD病变中的变化及可能作用仍缺乏明确结论。本研究利用原代培养海马神经元和痴呆大鼠模型探讨BMP4在Aβ毒性病变中的表达变化以及潜在的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 采用Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠16只，体质量200～220 g。购自中国科学院上海实验动物中心，饲养于中国科学院药物研究所实验动物中心(清洁级环境)，动物的使用符合上海市动物管理委员会管理条例。将SD大鼠随机分为Aβ注射组和空白对照组，每组8只。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠胆碱能神经元损伤模型：大鼠以10% (质量浓度)水合氯醛麻醉，固定于BAS立体定向仪上，将齿棒定为-2.4 mm。前囟后1.4～1.6 mm，旁开2.5 mm，钻颅缓慢进针深度7 mm，Aβ注射组采用1 μL的微量注射器和微量推进器在双侧基底前脑Meynert核各注射10 μg/μL Aβ1-40(Sigma公司)1 μL，注射时间10 min，注射完毕后，针停留5 min，缓慢拔出，然后用同样的方法再注射另一侧[7-8]。对照组采用等剂量的PBS溶液注射。手术后第11天开始进行水迷宫实验训练，经过5 d水迷宫训练后，采集入水后寻找到平台的时间。水迷宫实验后取大鼠海马和基底前脑脑组织。

1.2.2 原代海马神经元培养：取孕15～17 d的SD大鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)，无菌条件下取胎鼠海马，0.125%(质量浓度)胰蛋白酶消化，加入10%(体积分数)胎牛血清培养基终止消化，吸管吹打组织20次，收集细胞悬液，接种在多聚赖氨酸包被的培养板中，放入培养箱，24 h后换不含血清的培养液(1% 谷氨酸盐+2% B27+97% Neurobasal)(Gibco公司)，48 h后加阿糖胞苷，作用24 h后全量换液，此后每3 d半量换液。当神经元纯度达到80%～90%后用于后续实验。

1.2.3 提取与扩增BMP4 mRNA：将Aβ25-35(Sigma公司)溶解于0.1%(质量浓度)三氟乙酸溶液中，配成1 mmol/L储存液，临用前置于37 ℃孵箱中孵育3 d进行老化处理，使可溶性Aβ聚集成不溶性Aβ[9]。将培养的原代海马神经元随机分为4组，分别用不同浓度Aβ25-35处理海马神经元，使Aβ25-35终浓度分别为10、15、20 μmol/L；另设立阴性对照，添加等量三氟乙酸溶液。孵育24 h后用总RNA提取(TRIzol)法提取总RNA。实验步骤严格按Realtime PCR试剂盒说明书进行(Takara公司)[9]。用Bio-Rad定量PCR仪(Bio-Rad公司)设置预变性95℃ 10 s，PCR反应95℃ 5 s，依据相应的退火温度持续30 s，循环40次。BMP4和β-actin cDNA基因全长由Pubmed Genebank查得，委托上海生物工程公司代为设计并合成。PCR扩增引物如下：BMP4：上游：5′-CGTTACCTCAAGGGAGTGG-3′，下游：5′-GCGACGGCAGTTCTTATTC-3′；β-actin：上游：5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′，下游：5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′。

BMP4片段长度为158 kp，退火温度56℃；β-actin片段长度241 kp，退火温度60℃。PCR产物含量依据2-△△Ct计算。每个实验独立重复3次，取均数。

1.2.4 免疫印迹分析：将冻存的脑组织研磨，制备匀浆。采用Bradford法检测蛋白浓度，细胞蛋白提取物在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，采用湿转法转膜，转膜结束后，丽春红及考马斯亮蓝染色。聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜浸入5%(质量浓度)脱脂奶粉的TBST室温封闭。一抗为兔抗大鼠BMP4(1∶500)或β-actin抗体(1∶2000，Abcam公司)，二抗为HRP标记的山羊抗兔抗体(1∶500，碧云天公司)，通过电化学发光(electro-chemical luminescence，ECL)试剂盒发光显影。采用Bio-Rad2000型凝胶成像系统将光片在白光下扫描后，应用Quantity One软件(Bio-Rad公司)进行灰度扫描分析。各组BMP相对水平以BMP条带灰度值与各自β-actin灰度扫描值的比值表示，并设空白对照组(对照组)BMP相对蛋白水平为1，计算Aβ处理组BMP相对蛋白水平相对于空白对照组的比值。每个实验独立重复3次，结果取均数。

1.2.5 免疫组化：大鼠脑组织免疫组化实验依据SP试剂盒说明书(Santa Cruz公司)步骤操作。石蜡切片(10 μm)常规脱蜡，30%(体积分数)H2O2室温下持续孵育切片10 min，以灭活内源性酶，之后切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温下持续孵育30 min。滴加稀释好的一抗(兔抗大鼠BMP4抗体1∶500)(Abcam公司)，4℃过夜。滴加生物素化山羊抗兔二抗(1∶500)(碧云天公司)，37℃ 20 min后PBS冲洗，DAB显色。围绕蓝色细胞核的细胞质呈明确棕色染色者即为BMP4阳性细胞。选取同一染色条件下的6～7张切片，每张切片随机取100个细胞，将图像摄入计算机，使用IMS图像分析系统(Nikon公司)设定基础统计面积，分别调定背景、阴性细胞、阳性细胞，通过计算机自动分析，得出阳性表达面积及阳性强度均值，按下列公式计算BMP4表达阳性指数：阳性指数=阳性表达面积×阳性强度均值。阳性指数越高表示目标蛋白表达越高。每个实验独立重复3次。

1.3 统计学处理 计量资料以均数±标准差表示，采用GraphPad Phrism 5软件进行分析，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni检验，两组均数间比较采用独立样本t检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 不同Aβ浓度组原代海马神经元BMP4基因转录水平 10、15、20 μmol/L Aβ处理组以及对照组原代海马神经元BMP4基因含量分别为0.483±0.035、0.280±0.139、0.100±0.006、1.000±0.098，4组间BMP4表达含量比较差异有统计学意义(F=60.52，P<0.05)。与对照组比较，不同Aβ浓度组海马神经元BMP4基因含量均降低(P<0.05)，且20 μmol/L Aβ处理组原代海马神经元BMP4基因含量较10 μmol/L Aβ处理组低(P<0.05)。

2.2 各组大鼠不同脑区BMP4蛋白表达

2.2.1 免疫印迹实验：与对照组相比，Aβ1-40注射组大鼠基底前脑区BMP4蛋白表达降低(P<0.05)，而海马区则较对照组高(P<0.05)。结果见图1、表1。

图1 大鼠不同脑区BMP4蛋白含量比较(免疫印迹法)

图2 各组大鼠不同脑区BMP4阳性细胞表达(箭头所示)比较(免疫组化×200)

2.2.2 免疫组化实验：结果见表1、图2。与对照组相比，Aβ1-40注射组基底前脑区内BMP4阳性细胞减少(P<0.05)，而海马区则呈现反向变化(P<0.05)。

3 讨论

AD是以渐进性的学习、记忆、行为和人格障碍为主要临床特征的神经精神疾病，Aβ在脑内的沉积是最典型的病理特征，Aβ具有神经毒性，通过产生氧化应激、代谢压力和兴奋性毒性诱导神经元损害[10]。BMP在神经发育期具有诱导细胞分化及增殖等作用[11]，近来研究结果显示，BMP在成熟神经系统中具有神经修复作用，并参与记忆学习过程。Fischer等[12]研究发现，BMP4可以对抗N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)介导的神经兴奋毒性，对神经元具有保护作用。Sun等[13]研究发现，BMPs内源性抑制剂Chordin敲除鼠脑内BMP增多，其短期记忆和学习能力明显增强，提示BMP与学习记忆具有一定关联。作者研究小组前期研究发现，BMP6/7蛋白在Aβ毒性病变中含量发生变化，不同脑区变化不同[9]；AD的发病机制与Aβ沉积于神经突触，诱导树突内骨架结构紊乱有关，而BMP的下游信号LIM激酶1(LIM kinase 1，LIMK1)通过cofilin蛋白调节肌动蛋白(actin)的解离与聚合，从而影响树突内骨架结构的形态[14]。与BMP6/7分属不同亚群的BMP4蛋白是否具有相同变化，以及BMP在AD发病中的潜在作用和意义需要进一步研究。

本研究选择10、15和20 μmol/L浓度的Aβ25-35处理培养7 d的海马神经元，24 h后通过Real time PCR方法检测BMP4 mRNA含量，结果显示Aβ25-35直接处理海马神经元可导致BMP4的基因转录减少。作者前期研究应用水迷宫试验证实Aβ1-40注射组大鼠具有记忆认知功能障碍[9]。本研究采用Aβ1-40注入大鼠双侧基底前脑建立胆碱能神经元损伤模型，利用免疫组化和免疫印迹方法检测基底前脑和海马区BMP4蛋白的表达情况，结果显示在基底前脑区，Aβ1-40可对基底前脑区神经元产生直接神经毒性，导致BMP4表达降低，这与Aβ25-35直接作用于原代海马神经元导致BMP4 mRNA含量降低的实验结果相一致，提示Aβ可直接引起BMP4转录和表达降低。而海马区BMP4蛋白表达则升高，提示BMP4可能参与Aβ毒性病变，并在不同脑区有不同表达。中枢神经系统的重要特征之一是各脑区之间存在双向联系，而基底前脑和海马区之间正是具有双向投射纤维[15]。基底前脑胆碱能系统主要包括腹侧纹状体、杏仁核、Meyner核、隔核及斜方体，隔核海马胆碱能投射纤维终止于海马区所有类型的神经元[16]。同时，海马区神经纤维元投射到隔核的外侧和内侧区，反馈海马区的信息[17]。隔核海马投射纤维的完整性对于海马同步化、记忆获取十分必要[18]。另外，基底前脑和海马区的双向递质传递对于海马反馈和信息纠正也十分重要。在本研究中，Aβ1-40注射到基底前脑区的大鼠模型，其海马区BMP4含量升高，故推测海马区BMP4上调是源于基底前脑区BMP4下调的负反馈。基底前脑区神经元及胶质细胞受到Aβ1-40的神经毒性作用，该区域神经元和胶质细胞受损严重，一方面直接导致神经元和胶质细胞内合成具有营养及保护作用的BMP4的功能下降，另一方面Aβ1-40可能通过其他拮抗蛋白降低BMP4的表达，其机制有待深入探讨。因本研究中Aβ注射区为基底前脑，故海马区未直接受到Aβ毒性攻击，较之基底前脑去相比，受毒性攻击的程度和时间上都会削弱，由于脑区间的双向投射系统的调节作用，海马区BMP4因负反馈而代偿性增多。通过海马区与基底前脑区的投射纤维环路，最终向受损区提供营养和保护支持。而基底前脑区与海马区的确切投射机制目前仍不明，有待于进一步研究。

本实验通过在转录及翻译水平上证实Aβ可诱导BMP4的转录和表达下调，提示BMP4可能参与AD病变，同时基底前脑和海马区的BMP4可能存在负反馈的自我调节功能，这为研究AD发病机制提供了一种潜在的思路。

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(本文编辑：时秋宽)

Research about the change of bone morphogenetic protein 4 expression in Aβ-induced neurotoxicity

ANNa,SUNLin*.

*DepartmentofGeriatricPsychiatry,ShanghaiMentalHealthCenter,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200030,China

SUN Lin, Email: xiaosuan2004@126.com

Objective To investigate the change of bone morphogenetic protein 4 (BMP4) expression in amyloid β(Aβ)-induced neurotoxicity. Methods Hippocampal neurons were treated with different concentrations of Aβ25-35 (10，15，20 μmol/L) for 24 h. The mRNA level of BMP4 in rat hippocampal neurons after Aβ25-35 treatment was assayed through realtime PCR.Invivo, Aβ1-40 was bilaterally injected into basal forebrain to simulate neuropathological processes of AD, and the levels of BMP4 protein were tested in the regions of basalforebrain and hippocampus. Results Results of realtime PCR showed that the levels of BMP4 mRNA in Aβ groups were significantly decreased compared with the control group. Immunohistochemisty and western blot results showed that BMP4 protein was significantly decreased in the Aβ group relative to the control group in basalforbrain, while there was an opposite change in hippocampus. Conclusions Aβ directly down-regulates BMP4 expression, and there may be anegative feedback regulation of BMP4 in different brain regions.

Alzheimer’s disease; bone morphogenetic proteins; amyloid beta-protein

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.002

国家自然科学基金资助项目(81301139)；上海市自然科学基金资助项目(13ZR1435900)：上海市精神卫生中心飞翔计划(2014-FX-04)

200030 上海交通大学医学院附属精神卫生中心老年科

孙琳，Email: xiaosuan2004@126.com

R749.1

A

1006-2963 (2015)04-0233-05

2014-12-02)