骨髓间充质干细胞对酒精诱导海马神经元损伤的作用研究

杨海玉 吴晓牧 刘勇 曾玉娥

骨髓间充质干细胞对酒精诱导海马神经元损伤的作用研究

杨海玉 吴晓牧 刘勇 曾玉娥

目的 通过体外观察骨髓间充质干细胞(BMMSC)对酒精诱导海马神经元损伤的作用，初步探讨BMMSC治疗酒精性痴呆(AAD)的可行性。方法 取胎鼠海马进行原代神经元培养并进行神经元纯度鉴定。酒精组给予100 mol/L酒精37℃培养24 h，建立酒精诱导海马神经元损伤模型；BMMSC+酒精组在其培养液中同时加入BMMSC条件培养液(终浓度为50%)及100 mol/L酒精，37℃培养24 h；另设相同浓度的BMMSC条件培养液对照组(BMMSC组)及空白对照组(对照组)。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活率，以碘化丙啶(PI)/Hoechst33342染色观察细胞形态及凋亡情况。结果 原代培养的海马神经元高表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)，低表达神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，提示成功培养了纯度较高的原代海马神经元。酒精组细胞存活率(0.80±0.09)低于对照组(1.00±0.11；t=4.128，P<0.01)及BMMSC组(1.04±0.07；t=-6.052，P<0.01)； BMMSC+酒精组细胞存活率(0.92±0.11)高于酒精组(t=2.555，P<0.05)。BMMSC组及BMMSC+酒精组细胞存活率与对照组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。酒精组可见较多的细胞核呈致密浓染及核碎裂的凋亡细胞，BMMSC+酒精组的凋亡细胞数量明显减少。结论 BMMSC可抑制酒精诱导的海马神经元凋亡发生，提示BMMSC移植治疗AAD可能具有一定可行性。

骨髓间充质干细胞；海马神经元；原代培养；凋亡；酒精性痴呆

大脑是酒精诱导损伤的最常见靶器官之一，长期大量饮酒可引起脑器质性损害，并逐渐发展至痴呆状态，称之为酒精性痴呆(alcohol-associated dementia，AAD)，临床以学习记忆功能受损为其主要特征表现，严重者日常生活不能自理[1-2]。目前研究认为，AAD的主要发病机制是由于酒精毒性造成海马组织结构破坏及其相关信号通路失调，特别是导致海马神经元大量凋亡，通常药物治疗很难达到理想的疗效[3-4]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell， BMMSC)是一类能自我更新并具多向分化潜能的干细胞。目前的研究显示BMMSC移植对于神经系统损伤及其导致的神经功能障碍具有较好的治疗作用，其机制包括减少神经元凋亡、促进神经细胞存活以及促进神经营养因子分泌等[5-7]。本研究以SD大鼠原代培养海马神经元为实验对象建立酒精诱导损伤模型，通过制备大鼠BMMSC条件培养液并与酒精诱导损伤的海马神经元共培养，进一步观察BMMSC对酒精诱导海马神经元损伤的作用，初步探讨BMMSC移植治疗AAD的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料 SD孕鼠和新生乳鼠购于江西中医学院实验动物部。培养原代海马神经元所需的Neurobasal培养基和B27培养基添加剂购于美国Gibco公司；培养大鼠BMMSC所需的DMEM/F12培养基及胎牛血清购自美国Hyclone公司；兔抗神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)单克隆抗体和兔抗神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)单克隆抗体购于武汉博士德生物公司；多聚-L-赖氨酸、FITC标记和TRITC标记二抗购自北京中杉金桥生物公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、Hoechst33342染色剂、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)及其他化学试剂购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 原代海马神经元培养和鉴定[8]：取胎龄为15～18 d的胎鼠于体视显微镜下分离海马组织，采用0.25%(体积分数)胰蛋白酶消化，加入Neurobasal培养基〔含2%(体积分数)B27〕吹打细胞悬液，调整细胞密度为2×105接种于6孔板，孔内预先放置包被多聚-L-赖氨酸的盖玻片。每3 d换液1次。细胞培养7 d后在倒置相差显微镜下观察形态并拍照取图。

同时，采用免疫荧光染色法对上述细胞进行神经元鉴定。细胞培养第7天取盖玻片，PBS轻洗3次，用4%(体积分数)多聚甲醛室温固定30 min。之后用0.1%(体积分数)Triton X-100处理 15 min，分别滴加一抗兔抗鼠NSE(1∶100)和GFAP(1∶100)4℃过夜。PBS洗3次后，分别滴加FITC标记和TRITC标记羊抗兔二抗(1∶300)，室温避光孵育1 h。之后以甘油缓冲液封片，荧光显微镜(型号DM3000，德国徕卡公司)观察取图。 NSE为神经元特异性标记物，阳性染色呈绿色荧光；GFAP为神经胶质细胞特异性标记物，阳性染色呈红色荧光。在高倍镜(400倍)下随机取3个视野，分别计算NSE、GFAP阳性细胞百分比。NSE表达高(>90%)，GFAP表达低(<5%)，提示神经元细胞纯度高并可用于下一步实验。

1.2.2 BMMSC培养和条件培养液制备：取2～3周龄SD乳鼠，游离双侧后肢股骨和胫骨，用含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM/F12 1∶1培养基冲洗骨髓腔，然后直接接种BMMSC于培养瓶。其具体培养及纯化方法参照文献[6]。取第3代BMMSC，于倒置相差显微镜下观察细胞生长至约90%融合，弃去原有培养液，加入10 mL无血清DMEM新鲜培养基(25 cm2培养皿)，于37℃培养24 h后收集培养液，300g离心5 min去除细胞碎片，-80℃冻存备用[9]。

1.2.3 实验分组和细胞处理[9]：实验分组包括空白对照组(对照组)、酒精组、BMMSC+酒精组及BMMSC组。对照组仅用DMEM培养基进行培养，酒精组用含100 mol/L酒精的DMEM培养基进行培养，BMMSC+酒精组用BMMSC条件培养基+100 mol/L酒精进行培养，BMMSC组用BMMSC条件培养基进行培养。将各组密度为2×105的海马神经元细胞悬液接种于预先包被多聚-L-赖氨酸的96孔板，置培养箱内培养6 d，每3 d换液1次。第7天所有细胞均更换仅含1%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基。BMMSC+酒精组和BMMSC组细胞在含BMMSC条件培养液(50%)的条件下预先孵育2 h(对照组和酒精组不含BMMSC条件培养液)，之后酒精组和BMMSC+酒精组加入酒精(终浓度为100 mol/L)，对照组及BMMSC组加入等量不含酒精的DMEM培养基，置培养箱中连续培养24 h，用于原代海马神经元MTT法检测细胞存活率和细胞凋亡情况。

1.2.4 原代海马神经元MTT检测细胞存活率：各组细胞经1.2.3所述处理后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃培养4 h。弃去所有溶液后加入200 μL DMSO溶液，振荡10 min，采用酶标仪570 nm波长检测吸光度〔D(λ)〕值，各组细胞处理相同。根据各组D(λ)值计算细胞存活率。D(λ)值越大，提示细胞存活率越高。

1.2.5 原代海马神经元凋亡检测：各组细胞经1.2.3所述处理后，弃去培养基，用PBS洗3次，然后每孔滴加适量PI染色液覆盖细胞，避光染色5 min，PBS洗3次；每孔滴加适量Hoechst33342染色液覆盖细胞，避光染色5 min，PBS洗3次。采用荧光显微镜观察并拍照，PI染色显示红色荧光，Hoechst33342染色显示蓝色荧光，荧光定位均在细胞核，提示染色成功。凋亡细胞的特征表现为细胞核呈明显固缩、浓染及核碎裂。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据采用均数±标准差表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较选择LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代海马神经元的形态与鉴定 从胎鼠海马组织分离培养的细胞具有典型神经元的形态特征，胞体较大、饱满，胞质丰富，核大、核仁隐约可见，突起明显增长(图1A)。荧光显微镜观察结果显示呈绿色荧光的NSE阳性细胞数量多，其阳性百分比为(96.7±1.53)%(图1B)；呈红色荧光的GFAP阳性细胞数量很少，阳性百分比为(3.30±0.57)%。该结果提示所分离培养的海马神经元纯度较高，可用于下一步实验。

A：培养7 d的原代海马神经元(倒置显微镜)；B：NSE 表达(免疫荧光染色)

图1 原代海马神经元形态及鉴定结果

2.2 原代海马神经元存活率检测 酒精组细胞存活率(0.80±0.09)低于对照组(1.00±0.11；t=4.128，P<0.01)及BMMSC组(1.04±0.07；t=-6.052，P<0.01)； BMMSC+酒精组细胞存活率(0.92±0.11)高于酒精组(t=2.555，P<0.05)。BMMSC组及BMMSC+酒精组细胞存活率与对照组比较差异无统计学意义(t=-1.018，P>0.05；t=1.469，P>0.05)。

2.3 原代海马神经元凋亡检测 酒精组可见较多的细胞核呈致密浓染及核碎裂的凋亡细胞(红色荧光标记，图2B)；BMMSC+酒精组的凋亡细胞数量明显减少(图2C)；对照组(图2A)及BMMSC组(图2D)中所见的神经元胞核形态正常(蓝色荧光标记)。

3 讨论

目前研究认为，酒精对学习记忆的影响并不是作用于整个大脑，而是针对某些特定脑区尤其是海马结构，酒精毒性导致海马神经元大量凋亡则是其主要病理机制[3-4]。海马是神经元高度集中的部位，在学习、记忆、情绪反应及自主神经功能等方面具有重要作用，并且海马与周围脑组织界限明确、易于分离，因此常作为神经科学领域的体外研究对象。本研究成功培养了纯度较高的原代海马神经元，实验结果显示，与对照组相比，酒精(100 mol/L)作用24 h后海马神经元存活率降低，并发生明显凋亡，提示酒精对海马神经元存活具有明显的抑制作用，并且可诱导其发生凋亡。因此，可以认为酒精诱导的原代海马神经元损伤模型能反映AAD主要发病机制，是一种较为理想的AAD体外研究模型。

A：对照组；B：酒精组；C：BMMSC+酒精组；D：BMMSC组

图2 原代海马神经元凋亡情况：图中红色荧光标记为PI染色，蓝色荧光标记为Hoechst33342染色(免疫荧光)

近年来广泛开展的干细胞研究取得了显著进展，为各种损伤性疾病尤其是不可逆性损伤的治疗提供了新的思路和方法。研究认为干细胞治疗的有效性与其旁分泌机制密切相关：干细胞自身可分泌各种营养因子和细胞因子，从而发挥不同的生理学作用[10]。BMMSC具备来源广泛、取材方便、在合适的体外培养条件下能迅速增殖且不产生免疫排斥等优势条件，具有广阔的临床应用前景。现有研究证实体外培养的BMMSC具有自分泌能力，能分泌一些神经营养因子包括神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等[11-12]。上述神经营养因子在体内外均能促进神经细胞的增殖分化，同时也能抑制各种因素诱导的神经细胞凋亡，对神经系统的损伤修复具有重要保护作用。Liu等[9]的研究显示，BMMSC条件培养液中含有较高水平的NGF、bFGF及BDNF等因子，并且采用BMMSC条件培养液对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC-12细胞)进行预处理，能够明显抑制酒精诱导的细胞凋亡。同样，本实验结果显示BMMSC+酒精组细胞存活率明显高于酒精组，凋亡细胞数量也明显少于酒精组，提示BMMSC条件培养液可促进受损原代海马神经元存活并抑制酒精诱导的凋亡。以上研究提示BMMSC可能通过旁分泌机制对酒精诱导神经元损伤产生保护作用。

综上可见，BMMSC条件培养液可促进受损原代海马神经元存活并抑制酒精诱导的凋亡，利用BMMSC移植治疗AAD可能具有一定的可行性。然而，在临床实践中要达到所期望的治疗效果仍面临许多的困难和挑战，需要进行更多的基础和临床研究来明确BMMSC的作用机制，并进一步优化BMMSC的移植条件，以期为BMMSC的临床应用提供充分的实验参考依据。

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(本文编辑：邹晨双)

The effect of bone marrow mesenchymal stem cell on alcohol-induced hippocampal neuron injury

YANGHaiyu*,WUXiaomu,LIUYong,ZENGYu’e.

*InstituteofClinicalMedicalSciences,JiangxiProvincePeople’sHospital,NanchangJiangxi330006,China

YANG Haiyu, Email：yanghaiyu@yahoo.com

Objective To observe in vitro effects of bone marrow mesenchymal stem cell (BMMSC) on alcohol-induced hippocampal neuron injury and discuss the feasibility of alcohol-associated dementia (AAD) treatment with BMMSC transplantation. Methods Hippocampal neurons got from fetal rats were primary-cultured for 6 days and identified with immunofluorescence staining. Then they were divided into four groups. Some cells were treated with ethanol (100 mol/L) for 24 h in 37℃ (the ethanol group). BMMSC-conditioned medium (the concentration was 50%) was prepared and co-cultured with ethanol-treated cells for 24 h (the BMMSC+ethanol group). The BMMSC group was treated with BMMSC-conditioned medium (the concentration was 50%). For the control group, cells were treated only with DMEM medium. The cell viability was analyzed with MTT assay. The staining with propidium iodide (PI)/Hoechst33342 was used to observe cell apoptosis. Results Primary-cultured hippocampal neurons were NSE-positive and GFAP-negative, suggesting that primary hippocampal neurons with high purity were successfully cultivated. As compared with the control group (1.00±0.11) and the BMMSC group (1.04±0.07), the cell viability of the ethanol group significantly decreased (0.80±0.09,P<0.01). As compared with the ethanol group, the cell viability of the BMMSC+ethanol group significantly increased (0.92±0.11,P<0.05). Cell apoptosis was apparently induced by treatment of ethanol (100 mol/L) for 24 h. However, co-cultured with BMMSC-conditioned medium (50%, 24 h), these effects of ethanol on hippocampal neurons were prevented. Conclusions BMMSC plays a role to inhibit alcohol-induced hippocampal neuron apoptosis and it suggests that BMMSC transplantation is promising for AAD treatment.

bone marrow mesenchymal stem cell; hippocampal neuron; primary culture; apoptosis; alcohol-associated dementia

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.010

国家自然科学基金资助项目(81060111)；江西省卫生厅中医药科研基金重大课题(2013Z005)

330006 江西省人民医院，临床医学研究所(杨海玉、吴晓牧、曾玉娥)，病理科(刘勇)

杨海玉，Email：yanghaiyu@yahoo.com

R741.02

A

1006-2963 (2015)04-0269-04

2013-12-20)