pEGFP-N1-APOE ε2重组质粒的构建与鉴定

王健 王玉洁 辛岳 姜新

pEGFP-N1-APOE ε2重组质粒的构建与鉴定

王健 王玉洁 辛岳 姜新

目的 构建pEGFP-N1-APOEε2真核表达重组质粒。方法 应用基因定点突变手段，根据载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因cDNA克隆基因序列和表达载体增强绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-N1)质粒上的多克隆位点设计引物，对质粒APOE基因cDNA克隆(pMD18-T-APOE3)进行基因定点突变，得到含有APOE2基因的目的片段，将此目的片段插入载体启动子下游，与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因融合。重组质粒经菌液PCR、限制性内切酶酶切和测序，鉴定目的基因是否成功插入pEGFP-N1质粒。结果 对所得pEGFP-N1-APOE ε2质粒插入部分测序结果显示，pEGFP-N1-APOE ε2质粒的方向及序列正确，阅读框正确无误，表明APOEε2基因定点突变正确，重组pEGFP-N1-APOE ε2质粒构建成功。结论 成功构建了pEGFP-N1-APOE ε2真核表达重组质粒。

APOE ε2基因；真核表达质粒；基因重组；绿色荧光蛋白

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以痴呆为主要临床表现的神经系统变性病，主要病理改变是以淀粉样蛋白为核心的老年斑和神经原纤维缠结沉积，目前AD病因不明，缺乏有效治疗方法。1991年，Pericak-Vance等发现位于第19号染色体上的载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因与AD有关[1]，之后发现APOE 基因多态性(ε2、ε3和ε4)与AD关系非常密切[2]。ε4等位基因型是晚发性AD遗传高危因素[3]，携带ε4等位基因者平均AD发病年龄低，携带ε2等位基因者平均AD发病年龄较高[4]。AD患病风险与这些等位基因叠加有关，即ε4/ε4基因型患AD的风险高于ε3/ε4 或ε2/ε4基因型，ε2/ε2基因型比只有一个ε2等位基因的基因型更不易罹患AD。上述结果在大量研究和多个种族群体中得到重复验证[5]，其他研究表明ε2基因具有对抗AD的作用[6-7]。另有试验研究发现，海马CA3区内注射慢病毒为载体的人类ε2基因5周后，过表达人类淀粉样蛋白前体鼠(即PDAPP转基因小鼠)淀粉样蛋白沉积减少30%～50%[8]。基于此，本研究旨在构建以增强绿色荧光蛋白(EGFP)为载体的 APOEε2质粒，期望为AD基因治疗研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 质粒APOE基因cDNA克隆(pMD18-T-APOE3)购于北京义翘神州生物技术有限公司；PrimeSTAR®HS DNA Polymerase(具有高保真性和高扩增效率的PCR的DNA聚合酶)、 TaKaRa MiniBEST琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒3.0、DL2 000 DNA Marker、In-Fusion®高品质基因克隆套件(In-Fusion®HD Cloning Kit)、Supercoiled DNA Ladder Marker均购于宝生物工程大连有限公司。PCR扩增仪TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600(TaKaRa公司)；核酸电泳仪Mupid(ADVANCE-BIO Co.,Ltd)；电泳成像装置ImageMaster®VDS(Pharmacia Biotech)等。PCR引物由宝生物工程大连有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成：根据所购APOE基因cDNA克隆基因序列(共含有901 bp)，将目的基因中的第526 bp的碱基C突变为T，3′端去TGA终止子(以ATG为起始)，合成下列引物。包括：F01：TCTCGAGCTCAAGCTTATGAAGGTTC-TGTGGGCTGCG；F02：CTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACC；R01：ACTGCCAGGCACTTCTGCAGGTC；R04：GGCGACCGGTGGATCCCGGTGATTGTCGC。

1.2.2 目的片段制作：(1)PCR扩增：使用PrimeSTAR®HS DNA Polymerase，对质粒pMD18-T-APOE3进行PCR扩增。反应体系为：pMD18-T-APOE3(10 ng/μL),引物F01/F02(10 pmol/μL)，引物R01/R04(10 pmol/μL)各1 μL；dNTP Mixture(各2.5 mmol)4 μL；5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)10 μL；PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL，加dH2O至50 μL。反应条件：98℃变性10 s、60℃复性10 s、72℃延伸30 s，循环30次，最后72℃延伸10 min，于4℃保存。将引物F01/R01、F02/R04的扩增产物分别命名为PCR产物Ⅰ、PCR产物Ⅱ，取5 μL进行1%(质量浓度)琼脂糖凝胶电泳分析。APOE 基因cDNA克隆基因全长954 bp，其第526 bp的碱基C突变为T，按照实验设计要求，进行琼脂糖凝胶电泳后，PCR产物Ⅰ大小应略大于526 bp，PCR产物Ⅱ大小应略大于428 bp。(2)PCR产物纯化：对上述PCR产物使用TaKaRa MiniBEST琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒3.0进行切胶回收后，分别命名为InsertⅠ、InsertⅡ，回收产物对应上述PCR产物Ⅰ、PCR产物Ⅱ。

1.2.3 载体制作：(1)将质粒pEGFP-N1，使用Hind Ⅲ/BamHⅠ进行酶切。pEGFP-N1(200 ng/μL)5 μL，10×Buffer 5 μL，Hind Ⅲ(10 U/μL) 1 μL，BamHⅠ(10 U/μL)1 μL，加dH2O至50 μL。反应条件为37℃温育1 h。取上述酶切反应液5 μL 进行1%(质量浓度) 琼脂糖凝胶电泳。pEGFP-N1载体的大小为4733 bp，使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切胶回收电泳条带中约4.7 kb的DNA片段，将其命名为Vector。

1.2.4 融合、转化、阳性克隆筛选：使用In-Fusion®高品质基因克隆套件，将InsertⅠ、InsertⅡ和Vector载体连接，反应体系：Vector(约70 ng/μL)2 μL，InsertⅠ(约50 ng/μL)1 μL，InsertⅡ(约50 ng/μL)1 μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL，加dH2O至10 μL。反应条件：50℃15 min。转化后取5 μL 进行1%(质量浓度)琼脂糖凝胶电泳。pEGFP-N1-APOEε2质粒大小约为5.7 kb，根据Supercoiled DNA Ladder Marker对结果进行判定。

取上述转化产物2.5 μL热转化至感受态大肠杆菌(E.coliCompetentCell)JM109中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒作为pEGFP-N1-APOE ε2目标质粒，并送宝生物工程大连有限公司对该质粒进行测序。根据宝生物工程大连有限公司测序结果与实验设计DNA序列进行对比，以证明pEGFP-N1质粒中插入的901 bp基因片段为一开放阅读框架，实验设计中DNA序列是由APOE 3以及本实验所选择的突变位点得来的，如果测序结果和本实验设计序列一致，且方向正确，则表明载体构建成功。

2 结果

2.1 PCR扩增产物 根据所购APOE基因cDNA克隆基因提供的序列，将目的基因中的第526 bp作为突变位点，进行 PCR 产物扩增后，经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，在500 bp上方和下方出现特异性扩增条带(图1)，PCR产物Ⅰ所在位置在500 bp到750 bp之间，PCR产物Ⅱ大小在500 bp略下方，该两种产物长度符合实验结果预期。

M1：DL2000 DNA Marker；1：PCR产物Ⅰ；2：PCR产物Ⅱ

图1 PCR产物Ⅰ、Ⅱ琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 载体制作结果 使用Hind Ⅲ/BamHⅠ进行酶切后，pEGFP-N1-Hind Ⅲ/BamHⅠ质粒大小约为4.7 kb(图2)，符合实验结果预期，对其进行回收，即Vector。

M2：λ-Hind Ⅲ digest；1：pEGFP-N1-plasmid；2：pEGFP-N1-Hind Ⅲ/BamHⅠ

图2 pEGFP-N1质粒酶切液琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 目的基因与载体的连接 结果见图3。 pEGFP-N1载体本身大小约为4.7 kb，APOE 基因cDNA克隆片段约为1 kb，APOE ε2基因克隆到pEGFP-N1 载体上所得到pEGFP-N1-APOE ε2质粒大小约为5.7 kb，琼脂糖凝胶电泳结果符合本实验结果预期。

M：Supercoiled DNA Ladder Marker；1：pEGFP-N1-APOE ε2；2：pEGFP-N1

图3 pEGFP-N1-APOE ε2质粒和pEGFP-N1质粒琼脂糖凝胶电泳结果

2.4 测序鉴定结果 所得pEGFP-N1-APOE ε2质粒插入部分测序结果显示，pEGFP-N1-APOE ε2质粒的方向及序列正确，阅读框正确无误。以上结果表明APOE ε2基因定点突变成功，表明重组pEGFP-N1-APOE ε2质粒构建成功。

3 讨论

AD表现为进行性痴呆，是老年人致残重要原因之一[9]。流行病学研究显示，目前全球AD患者高达2 400万，预计2040年始患者总数将每20年增长1倍[10]。AD发病机制与APOE基因多态性密切相关[2]，其中APOEε4等位基因型是晚发性AD遗传高危因素[3]，APOEε2基因则有延缓AD发生的作用[6-7]。在APOE基因型中，APOEε3占78%，APOEε4占15%，ε2基因仅占7%[11]；三者分别编码APOE蛋白E2、E3和E4。目前人类能够自然得到的APOE基因型仅有ε3，它与APOEε2的区别在于第526位碱基不同，APOEε3为C，APOEε2为T。本研究通过基因定点突变技术将APOEε3的526位C突变为T，即获得了APOEε2；通过酶切和融合，把目的基因APOEε2连接到pEGFP-N1上。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)具有独特发光机制，可作为蛋白质标签，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因，构成融合基因，转染至合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。GFP相对较小，只有238个氨基酸，与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能和宿主细胞功能。pEGFP为GFP 突变类型，产生的荧光较突变前强35倍，明显提高了其“标签”的敏感度。pEGFP其N及C端均可融合其他蛋白，并不影响蛋白的发光特性。pEGFP-N1载体含高效启动子，复制能力很强，可使目的基因稳定表达；而且pEGFP-N1载体具有目的基因插入的多克隆位点。在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可直接观察到绿色荧光而蛋白本身性质稳定。既往有试验发现转染了GFP基因小鼠可用于研究神经发生和神经生理，GFP在活体和离体神经元中都可以表达，在胚胎脑和成熟脑中均表达，而且GFP的表达对神经元生理没有明显影响；表达GFP的神经元形态、细胞功能和细胞生存与非表达GFP神经元相同[12]。研究表明含有终止密码子、编码EGFP的cDNA插入紧邻翻译起始部位的鼠APOE基因位点后，建立了报告基因鼠EGFPapoE ，此时EGFP就成为APOE体内表达的实时定位标志物，而且余下的等位基因足以维持正常细胞功能。报告基因鼠EGFPapoE对于研究APOE中枢神经系统表达的调节、深入研究APOEε4相关的神经系统变性疾病多种机制很有帮助[13]。

本研究将突变获得的APOEε2基因片段连接到pEGFP-N1载体上，构建了重组的pEGFP-N1-APOEε2质粒，并经测序鉴定证实pEGFP-N1-APOE ε2真核表达重组质粒构建成功。通过不同途径将pEGFP-N1-APOE ε2质粒转染至AD模型脑组织中，观察重组质粒的荧光和ApoE2蛋白表达情况，以及ApoE2蛋白对AD模型脑组织老年斑等病理变化的影响，对AD基因治疗研究提供试验依据。目前，国内已有人成功构建了人AChR-Fc融合蛋白真核表达载体[14]，如果同时构建pEGFP-N1-APOEε4质粒，并与pEGFP-N1-APOEε2质粒对比研究，可能对于AD发病机制和治疗的探讨更有帮助。

[1]Pericak-Vance MA, Bebout JL, Gaskell PC, et al. Linkage studies in familial Alzheimer disease: evidence for chromosome 19 linkage[J]. Am J Hum Genet, 1991,48:1034-1050.

[2]Strittmatter WJ, Saunders AM, Schmechel D, et al. Apolipoprotein-E: high-avidity binding to beta-amyloid and increased frequency of type 4 allele in late-onset familial Alzheimer disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 1977-1981.

[3]Mahley RW, Rall SC Jr. Is epsilon4 the ancestral human apoE allele?[J]. Neurobiol Aging, 1999,20:429-430.

[4]Corder EH, Saunders AM, Strittmatter WJ, et al. Gene dose of apolipoprotein-E type-4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families[J]. Science, 1993, 261: 921-923.

[5]Farrer LA, Cupples LA, Haines JL, et al. Effects of age, sex, and ethnicity on the association between apolipoprotein E genotype and Alzheimer disease: a meta analysis[J]. JAMA, 1997, 278: 1349-1356.

[6]Chartier-Harlin MC, Parfitt M, Legrain S, et al. Apolipoprotein Eε4 allele as a major risk factor for sporadic early and late-onset forms of Alzheimer’s disease: analysis of the 19q13.2 chromosomal region[J]. Hum Mol Genet, 1994,3: 569-574.

[7]Corder EH, Saunders AM, Risch NJ, et al. Protective effect of apolipoprotein E type 2 allele for late onset Alzheimer disease[J]. Nature Genet, 1994, 7:180-184.

[8]Dodart JC, Marr RA, Koistinaho M, et al. Gene delivery of human apolipoprotein E alters brain Abeta burden in a mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2005, 102(4):1211-1216.

[9]Alagiakrishnan K, Gill SS, Fagarasanu A, et al. Genetics and epigenetics of Alzheimer’s disease[J]. Postgrad Med J, 2012, 88: 522-529.

[10]Reitz C, Brayne C, Mayeux R. Epidemiology of Alzheimer disease[J].Nat Rev Neurology, 2011,7(3):137-152.

[11]Strittmatter WJ, Roses AD. Apolipoprotein E and Alzheimer disease[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92(11): 4725-4727.

[12]van den Pol AN, Ghosh PK.Selective neuronal expression of green fluorescent protein with cytomegalovirus promoter reveals entire neuronal arbor in transgenic mice[J]. J Neurosci, 1998, 18(24):10640-10651.

[13]Xu Q, Bernardo A, Walker D, et al. Profile and regulation of apolipoprotein E (ApoE) expression in the CNS in mice with targeting of green fluorescent protein gene to the ApoE locus[J]. J Neurosci, 2006, 26(19): 4985-4994.

[14]常婷,林宏,刘煜，等.人AChR-Fc融合蛋白真核表达载体的构建和表达[J].中国神经免疫学和神经病学杂志, 2011,18(4): 276-279.

(本文编辑：邹晨双)

Construction and verification of pEGFP-N1-APOE ε2 recombinant plasmid

WANGJian,WANGYujie*,XINYue,JIANGXin.

*DepartmentofNeurologyand,LiaoningProvincialHospital,ShenyangLiaoning110016,China

WANG Yujie, Email: wangyujie196508@163.com

Objective To construct enhanced green fluorescent protein(EGFP) labled eukaryotic expression recombinant plasmid of APOE ε2 gene. Methods According to the sequence of cDNA cloning gene of APOE gene and the multiple clone site of the expression vector pEGFP-N1 plasmid, two specific pairs of primers were desinged and synthesized by site-directed mutation. PCR amplification was carried out on the pMD18-T-APOE3, and an target fragment was acquired. The target fragment was inserted into the carrier promoter downstream and was fused into EGFP gene fusion. The recombinant plasmid was verified by PCR of the bacterium liquid, restriction enzyme digestion and gene sequencing. Results The inserted part of pEGFP-N1-APOE ε2 plasmid showed that the direction and sequence pEGFP-N1-APOE ε2 plasmid and the reading frame were correct. The results showed that site-directed mutagenesis of APOE ε2 was correct and recombinant pEGFP-N1-ApoE ε2 plasmid was successful.Conclusions The pEGFP-N1-APOE ε2 eukaryotic expression recombinant plasmid was successfully constructed

APOE ε2 gene; eukaryotic expression plasmid; genetic recombination;green fluorescent protein

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.003

辽宁省自然科学基金计划(201102105)

110016 辽宁省人民医院神经内科

王玉洁，Email：wangyujie196508@163.com

R743.9

A

1006-2963 (2015)04-0237-04

2014-01-23)