CYP2C19基因多态性指导下的抗血小板个体化治疗

吴龙梅，徐威，田新利，衣桂燕，李俊峡

• 论著 •

CYP2C19基因多态性指导下的抗血小板个体化治疗

吴龙梅，徐威，田新利，衣桂燕，李俊峡

目的探讨CYP2C19基因多态性指导下的抗血小板个体化治疗对冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）支架植入术后患者临床预后的影响。方法入选2013年11月至2014年5月因急性冠脉综合征（ACS）就诊并成功完成经皮冠状动脉介入术（PCI）的患者338例，最终纳入符合条件的患者301例。随机分为常规治疗组和个体化治疗组两组，常规治疗组给予阿司匹林+氯吡格雷抗血小板治疗，个体化治疗组根据CYP2C19基因多态性分为LOF+组和LOF-组，LOF+组给予阿司匹林+替格瑞洛治疗，LOF-组仍给予阿司匹林+氯吡格雷治疗。随访9～12个月内主要出血事件和心血管缺血事件的发生率。结果两组患者性别、年龄、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟多支病变、支架植入数目、辅助检查（总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、肌酐、尿酸）等方面均无统计学差异（P均＞0.05）。两组安全终点（主要出血事件）和疗效终点（主要不良心血管事件、支架内血栓、再发心绞痛）均无统计学差异（P均＞0.05）。结论根据基因多态性指导抗血小板治疗未能降低心血管终点事件的发生。

CYP2C19；氯吡格雷；替格瑞洛；个体化抗血小板治疗

临床治疗提供更多的循证医学证据。

1 对象与方法

1.1 研究对象本研究入选2013年11月至2014年5月因ACS就诊北京军区总医院心内科并成功行PCI治疗的患者338例，最终纳入301例患者（5例要求终止实验，23例失访，9例因终止双联抗血小板药物被剔除），其中男性245例（81.4%），女性56例（18.6%），平均年龄（59.2±9.5）岁。本研究经北京军区总医院伦理委员会批准。

入选标准：①汉族，年龄18～75岁；②明确诊断为ACS（包括不稳定性心绞痛、ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死）并成功行PCI治疗且长期服用双联抗血小板药物的患者；③志愿参加，签署知情同意书。

排除标准：①严重的肝肾功能损害者（转氨酶超过正常3倍以上、血肌酐≥177μmol/L）；②近期有活动性出血、有出血倾向或近期接受大手术者；③有显著窦性心动过缓或存在二度以上房室传导阻滞者；④对阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛有过敏者；⑤预期寿命小于9个月者；⑥研究者认为存在其他不适合参加本试验的原因。

1.2 主要试剂与仪器主要试剂：全血基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），SNP通用试剂盒（瑞典Biotage 公司），PCR 反应体系试剂（北京博迈德生物技术有限公司），引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）。主要仪器：聚合酶链式反应( PCR ) 仪（美国Biometra公司），Mikro 120 高速离心机（德国Hettich 公司），水平电泳仪（DYY-6C）（北京六一实验仪器厂），焦磷酸测序仪（Pyrosequenc ingTMPyroMark ID 系统）（瑞典Biotage 公司）。

1.3 方法所有患者以1:2比例随机分入常规治疗组（阿司匹林100 mg/日+氯吡格雷75 mg/日）和个体化治疗组。个体化治疗组根据基因多态性分为2个亚组，基因多态性由药理科临床基因扩增检验实验室完成，于PCI术前/后采血2 ml（EDTA抗凝管，短紫），通过焦磷酸测序完成CYP2C19两个重要多态性位点（rs4244285，rs4986893）的分型，根据是否携带突变等位基因（任一多态性位点的GA和AA）分为LOF+组和LOF-组，LOF+组给予阿司匹林100 mg/日+替格瑞洛90 mg 2/日，LOF-组仍给予阿司匹林100 mg/日+氯吡格雷75 mg/日。

1.3.1 研究分组所有患者以1:2比例随机分入常规治疗组和个体化治疗组。常规治疗组于支架置入术后口服阿司匹林100mg/日+氯吡格雷（商品名：波立维，杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产）75 mg/日。个体化治疗组根据患者是否存在CYP2C19*2或CYP2C19*3功能缺失等位基因分为LOF+、LOF-2个亚组，LOF+组为携带功能缺失等位基因（CYP2C19*2或CYP2C19*3任一多态性位点的GA和AA）组，支架置入术后给予阿司匹林100 mg/日+替格瑞洛（瑞典阿斯利康制药有限公司生产）90 mg 2/日；LOF-组为不携带功能缺失等位基因组，支架置入术后给予阿司匹林100 mg/日+氯吡格雷75 mg/日。所有患者服用双联抗血小板药物持续时间至少9个月。

1.3.2 观察指标记录患者一般资料（年龄、性别、体质指数）、冠心病危险因素（高血压、糖尿病、高脂血症吸烟）、辅助检查结果（总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、肌酐、尿酸）及冠状动脉造影资料（支架数目、病变支数、是否为多支病变）。

1.3.3 CYP2C19基因多态性的检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性由北京军区总医院药理科临床基因扩增检验实验室完成。于PCI术前/后采血2 ml（EDTA抗凝管，短紫），3 d内送至实验室。具体步骤包括：①人血基因组DNA的提取、质量检测及存储：按照TIANamp血液白细胞基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。用紫外分光光度计检测DNA样本的质量，注明样本编号，放置过夜。②标签SNP的选择：从HapMap数据库的汉族人群样本中选择上述两个位点（CYP2C19*2：rs4244285；CYP2C19*3：rs4986893）进行研究。③引物设计与合成用Assay Design Software Version1.0.6软件设计用于CYP2C19*2和CYP2C19*3焦磷酸测序的引物，具体引物如下：CYP2C19*2：上游引物：5’-CCGTAGTAAACACAAAACTAGTC AATG-3’，下游引物：5-GATATGCAATAAT TTTCCCACTA-3’，测序引物：Pseq 5’-TTA AGTAATTTGTTATGGGT-3’；CYP2C19*3：上游引物：5’- TTGTTTCCAATCATTTAGCTT CA-3’，下游引物：5’- GTCAATATAGAAT TTTGGATTTCCC-3’，测序引物：Pseq 5’-TTGTAAGCACCCCCT-3’。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。⑤PCR扩增：通过聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）方法扩增DNA片段。⑥PCR产物检查：2%琼脂糖凝胶将扩增产物处理后在凝胶成像仪上观察。⑦酶切检测rs4244285、rs4986893位点SNP基因型。⑧焦磷酸测序：具体步骤参照瑞典Biotage公司生产的PyroMark测序仪和SNP通用试剂盒的说明书进行测序。根据检测序列的碱基序列判断突变类型：野生型（CYP2C19*1/*1）G/G，突变杂合子（C Y P 2 C 1 9*2/*1、

CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*3）G/A，突变纯合子（CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3）AA。突变纯合子及突变杂合子均为CYP2C19功能缺失等位基因者。

1.4 研究终点及随访安全性终点指标：主要出血事件。主要出血事件为颅内出血或临床可见出血（包括影像学）伴血红蛋白浓度下降≥5 g/dL[4]。疗效性终点指标：主要不良心血管事件（MACE）、支架内血栓、再发心绞痛。MACE包括心源性死亡、非致死性心肌梗死、卒中及靶血管再次血运重建。随访时间为9～12个月，由专人进行电话随访，详细记录事件发生情况，并统一填写表格。

1.5 统计学处理采用SPSS19.0软件包进行分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用独立样本t检验；计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验，P＜0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况常规治疗组和个体化治疗组在性别构成、年龄、体质指数、高血压病、糖尿病、高脂血症、吸烟、肌酐、空腹血糖等临床基线资料方面无统计学差异（P均＞0.05）。两组患者在多支病变、病变支数、支架置入数目方面无统计学差异（P均＞0.05）（表1）。

2.2 两组患者安全性终点和疗效性终点比较个体化治疗组发生1例主要出血事件（消化道大出血，血红蛋白短时间内下降大于50 g/L），但与常规治疗组比较无统计学差异（P＞0.05）。两组患者在MACE、再发心绞痛、支架内血栓发生率均无计学差异（P＞0.05）（表2）。

3 讨论

氯吡格雷作为急性冠脉综合征PCI术后患者的常用药，其本身是一种前体药物，需要经过肝脏细胞色素P450系列酶代谢才能发挥抗血小板作用。CYP2C19是氯吡格雷代谢通路上的关键酶，该酶的活性受CYP2C19基因多态性的影响。目前已发现CYP2C19等位基因28种， CYP2C19*3和CYP2C19*2是中国汉族人群中最常见的功能缺失等位基因[5]。因此，本研究主要通过检测CYP2C19*3 和CYP2C19*2指导PCI术后抗血小板治疗。本研究中携带该两种或其中一种等位基因的发生率为40.7%，与既往研究报道相近[1]。

国内外研究发现，与CYP2C19正常基因型患者相比，无论单个或是两个功能缺失等位基因的患者，其体内的氯吡格雷活性代谢物水平降低，抑制血小板作用减弱，患者再发心血管事件风险增高[6-10]。目前研究CYP2C19基因多态性对氯吡格雷低反应现象的方式有两种，一种是实验室检查，即测定服药后血液中血小板聚集、氯吡格雷代谢产物等；另一种是临床观察，即观察患者临床症状、缺血事件发生及远期预后等。对氯吡格雷低反应患者应采用出血风险小、抗血小板作用强的新型抗血小板药物替格瑞洛。本研究通过对入组患者进行随访发现，常规治疗组发生1例MACE事件，个体化治疗组发生2例MACE事件，均为靶血管再次血运重建；常规治疗组发生1例支架内血栓，个体化治疗组未观察到；常规治疗组再发心绞痛的发生率为9.2%，个体化治疗组为17.2%；组间均无统计学差异，与既往研究不一致[11]，推测可能与入组病例少、临床环境因素、未行全部功能缺失等位基因检测等原因有关，还需大样本缜密设计的前瞻性临床试验证明。

国内外研究均已证实CYP2C19 基因多态性可导致血小板对氯吡格雷反应的可变性。临床上通过对PCI术后患者的CYP2C19基因多态性进行早期检测，应该可以根据其不同基因多态性位点对氯吡格雷作用的影响来合理优化用药方案，实现个体化治疗。但是，对于PCI术后患者常规检测CYP2C19基因多态性指导临床治疗是存在争议的，国内这方面的研究也很少。目前国内专家多建议对血栓形成高风险患者检测基因多态性的同时进行血小板功能检测[12]，但ARCTIC-Gene研究

与国内相关研究对这两种检测方法所呈现趋势的分析结果并不一致，因此仍然需要更多临床数据支持。另外，CYP2C19 的基因多态性分布存在明显的种族和地域差异，亚洲人群中CYP2C19 * 2变异型等位基因频率明显高于白人和非洲裔美国人[13]，因此对不同种族及不同地域人群进行氯吡格雷低反应性的基因多态性研究也很有必要。

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（责任编辑：田国祥）

Anti-platelet individual treatment guided by CYP2C19 polymorphism

WU Long-mei*, XU Wei, TIAN Xinli, YI Gui-yan, LI Jun-xia.*Department of Cardiology, General Hospital of Chinese PLA Beijing Military Area Command, Beijing 100700, China.

ObjectiveTo investigate the influence of anti-platelet individual treatment guided by CYP2C19 polymorphism on prognosis in patients with coronary heart disease (CHD) after stent implantation.MethodsThe patients (n=338) hospitalized and accepted success PCI due to acute coronary syndrome (ACS) were chosen from Nov. 2013 to May 2014, and finally 301 eligible patients were brought into the study. All patients were randomly divided into routine group and individual group, and routine group was treated with aspirin+clopidogrel for anti-platelet treatment. The individual group was divided again into LOF+group and LOF-group according to CYP2C19 polymorphism, and LOF+group was treated with aspirin+ticagrelor and LOF-group was treated with aspirin+clopidogrel. The incidence rates of major bleeding events and cardiovascular ischemia events were followed up within 9 m to 12 m.ResultsThere was no statistical difference in sex, age, hypertension, diabetes, hyperlipidemia, smoking, multi-vessel lesion, number of stents and auxiliary examinations (total cholesterol, highdensity lipoprotein-cholesterol, low-density lipoprotein-cholesterol, fasting plasma glucose, creatinine and uric acid) between 2 groups (all P＞0.05). There was no statistical difference in safe endpoint (major bleeding events) and curative effect endpoint (major adverse cardiovascular events, in-stent thrombosis and reoccurrence angina pectoris) between 2 groups (all P＞0.05).ConclusionThe anti-platelet individual treatment guided by CYP2C19 polymorphism cannot reduce the incidence of cardiovascular endpoint events.

CYP2C19; Clopidogrel; Ticagrelor; Anti-platelet individual treatment

R558

A

1674-4055(2015)02-0207-04

首都临床特色应用研究(Z131107002213115)

100700 北京,北京军区总医院心内科

李俊峡,E-mail:18600090805@163.com

10.3969/j.1674-4055.2015.02.16现象及心血管不良预后与CYP2C19基因多态性有关，但根据基因多态性调整PCI术后抗血小板治疗（增加氯吡格雷剂量或改服药效更强的替格瑞洛）的临床获益并不明确[1,2]，既往多为小规模研究。另外，有研究表明CYP2C19 * 2为亚洲人群中的主要功能缺失（Loss-of-function，LOF）等位基因，与氯吡格雷抵抗密切相关，CYP2C19 * 3等位基因突变的发生率虽然低，但同样可造成蛋白功能缺失，影响氯吡格雷抗血小板作用[3]。因此本研究针对上述两个基因型进行分组研究，旨在探讨根据CYP2C19基因多态性指导PCI术后抗血小板治疗对心血管终点事件的影响，从而为

2014-10-10）

近年来，急性冠脉综合征（ACS）的发生率逐渐增加，经皮冠状动脉介入术（PCI）作为其重要的治疗手段在临床中的应用也越来越广泛，目前国内外临床指南均推荐PCI术后患者应采用阿司匹林+氯吡格雷的双联抗血小板治疗12个月，以降低心血管事件发生率。但是，氯吡格雷对血小板活性的抑制作用存在不同程度的个体差异，据报道约15%～48%的患者存在氯吡格雷低反应现象。已有大量研究证实，氯吡格雷低反应