三种不同方法测定鱼粉中氨基酸含量的比较

2015-01-21郝燕娟叶竹林赖彩冰彭志通

饲料工业 2015年10期

■李丰郝燕娟叶竹林赖彩冰彭志通

（广州汇标检测技术中心，广东广州 510300）

鱼粉是全世界使用最广泛、营养价值丰富的饲料蛋白原料，其含有动物生长所必需的氨基酸，且含量丰富、配比合理，在饲料、养殖业行业中起着不可代替的作用。随着我国饲料行业的发展，鱼粉需要量逐年增加，由于用量大、价格高，有些不法商家在鱼粉中掺入水解羽毛粉、血粉、肉骨粉和皮革粉等低价位的高蛋白质弄虚作假、以次充好，使鱼粉质量参差不齐。这种现象不但造成资源浪费，也为饲料企业和畜牧业带来经济损失。仅用粗蛋白含量作为指标，并不能正确反映出鱼粉的质量。因此，对鱼粉中氨基酸含量的测定有助于鱼粉质量的评价。据文献报道，鱼粉及饲料中氨基酸的测定方法主要有高效液相色谱法和氨基酸分析仪法，高效液相色谱法是采用邻苯二甲醛（OPA）、异硫氰酸苯酯（PITC）等衍生化试剂柱前衍生紫外或荧光检测，氨基酸分析仪法是采用茚三酮柱后衍生紫外检测。采用不同方法同时测定鱼粉中氨基酸含量，并对测定结果的相关性进行比较研究的文章未见发表。因此，本研究采用OPA、PITC柱前衍生HPLC分析和茚三酮柱后衍生氨基酸分析仪分析三种不同方法测定鱼粉中16种氨基酸含量，并对三种方法的结果进行比较，以了解这三种检测方法测定结果之间的相关性。

1 材料和方法

1.1 实验材料与主要仪器

鱼粉样品为市售进口鱼粉；16种氨基酸混标（Sigma）；邻苯二甲醛（Sigma）、异硫氰酸苯酯（Sigma）、茚三酮（Sigma）；乙腈（Merck）、甲醇（Merck）；纯净水（实验室自制）；其他试剂均为分析纯。

日立L-8900氨基酸分析仪，EZChromtion工作站；Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元泵、脱气机、自动进样器、紫外检测器、柱温箱、Agilent化学工作站；岛津LC-20A高效液相色谱系统，包括二元泵、自动进样器、SPD检测器、柱温箱、LC-solution工作站；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9030A，上海一恒）；天子天平（EL104，梅特勒）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

酸水解法：准确称取0.1～0.2 g样品，置于15 ml安瓿瓶中，加入10 ml 6 mol/l盐酸溶液，振摇使样品均匀分散在溶液中，充氮后立即用喷灯熔封，然后置于（110±1）℃烘箱中水解24 h，取出冷却、过滤，取水溶液2 ml，置于鸡心瓶中用旋转蒸发仪浓缩至干，加入5 ml的0.02 mol/l稀盐酸溶液溶解，用0.22 μm滤膜过滤后，取上清液备用。

1.2.2 氨基酸混合标准储备液的制备

精密量取16种氨基酸混标（2.5 μmol/ml）适量，用0.02 mol/l盐酸溶液配制成0.1 μmol/ml的混合标准储备液。

1.2.3 衍生方法

邻苯二甲醛衍生法：精密称取邻苯二甲醛15 mg，加0.4 mol/l硼酸缓冲液1 ml溶解，再加50 μl乙腈和15 μl巯代乙醇酸酯，涡旋混匀，然后采用Agilent 1100高效液相色谱仪自动进样器的程序进样完成柱前衍生。

异硫氰酸苯酯衍生法：准确量取水解后溶液和氨基酸标准工作液200 μl，分别置于1.5 ml离心管中，分别加入三乙胺乙腈溶液100 μl和异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μl，摇匀室温静置衍生1 h。衍生结束后分别加入400 μl正己烷，振摇并静置10 min，取下层溶液用0.45 μm滤膜过滤后备用。

1.2.4 AAA缓冲液和茚三酮反应液的配制

蛋白质水解系统缓冲液（pH-1、pH-2、pH-3、pH-4）、再生液（pH-RG）及茚三酮反应液的配制均参考日立L-8900氨基酸分析仪说明书配方。

1.2.5 色谱条件

邻苯二甲醛衍生法（Agilent HPLC）色谱条件：色谱柱为ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×150 mm柱；流动相A：0.04 mol/l磷酸二氢钠溶液（pH值7.82）；流动相B：甲醇-乙腈-水（45-45-10）溶液，流动相洗脱梯度见表1；流速2.0 ml/min，柱温40℃，波长338 nm。鱼粉样品的分离图谱见图1。

表1 梯度洗脱程序（OPA）

图1 鱼粉氨基酸的HPLC图谱（Agilent HPLC）

异硫氰酸苯酯衍生法（岛津HPLC）色谱条件：色谱柱为Sepax AAA 4.6 mm×250 mm柱；流动相A：0.1 mol/l醋酸钠-乙腈（93-7）溶液（pH值6.5）；流动相B：乙腈-水（80-20）溶液，流动相洗脱梯度见表2；流速1.0 ml/min，柱温36℃，波长254 nm。鱼粉样品的分离图谱见图2。

AAA测定条件：离子交换树脂EZChrom Elite 4.6 mm×60 mm柱，时间51 min，缓冲液流速0.4 ml/min，茚三酮流速0.35 ml/min，缓冲液泵压8～12 MPa，茚三酮泵压1.5～3.5 MPa，缓冲液改变次数3，分离柱温57℃、衍生柱温135℃，检测波长为440 nm和570 nm。鱼粉样品的分离图谱见图3。

表2 梯度洗脱程序（PITC）

2 实验结果和讨论

2.1 方法学验证

本研究对三种方法进行的完整的方法学研究，结果见表3。AAA法、OPA法和PITC法的标准曲线范围分别是5～500、10～500 μmol/l和10～500 μmol/l，相关系数r均大于0.999；AAA法多数目标物的检出限低于OPA法，而OPA法的检出限又优于PITC法，主要原因是AAA法的进样体积为20 μl、大于HPLC的5 μl，另PITC法用的是岛津HPLC的SPD检测器，灵敏度比紫外检测器要低一点；在回收率、精密度验证方面，三种方法的结果都比较相近。

图2 鱼粉氨基酸的HPLC图谱（岛津HPLC）

图3 鱼粉氨基酸的AAA图谱

2.2 测试结果的比较

本研究用三种不同方法对同一个鱼粉样品进行分析，将测得结果进行统计学分析，结果见表4。三种方法的三列测定结果两两配对进行线性回归，得到三个回归方程y=0.003 8x+1.004 7，相关系数r=0.997 3；y=10.073 4x+1.007 61，相关系数r=0.995 3；y=10.094 0x+1.036 1，相关系数r=0.998 0。三个回归方程的相关系数r都是大于0的，在统计学上看三者具有一定的相关性。对16种氨基酸测定结果采用F检验，得出的F值见表 4，F 值都小于 F0.95（5，6）4.39，说明三种方法的测定结果不具有显著性差异（其中Pro是两种方法的比较）。三种方法测定结果的平均相对标准偏差为3.10%，最大的为6.61%（Pro），最小的为0.91%（Thr），其中国家标准鱼粉两个重要氨基酸指标蛋氨酸、赖氨酸的相对标准偏差分别为2.11%和2.17%。

表3 方法学比较

表4 样品实测值比较

2.3 三种方法的比较分析

本研究采用的OPA法（Agilent HPLC）和PITC法（岛津HPLC）是相应仪器供应商根据各自仪器的特点推荐的柱前衍生方法。OPA衍生步骤简单、反应速度快，只需设置仪器程序进样就能完成柱前衍生步骤，OPA能和一级氨基酸发生衍生反应，不能和二级氨基酸直接反应，所以本研究中OPA法没有测定脯氨酸含量。有文献报道，可以采用OPA和氯甲酸芴甲酯（FMOC）两种衍生试剂结合衍生、FMOC与二级氨基酸衍生的办法解决OPA法的缺陷，不过这种方法可能会使反应条件的选择难度增大，同时也会对后续的分离带来更大的困难。PITC与一级、二级氨基酸均能反应，只是PITC法具有衍生反应条件严格、步骤相对复杂、毒性大、会降低分析柱寿命等缺陷。AAA法采用的是茚三酮在线柱后衍生，衍生反应迅速、稳定。

本研究采用了三种不同仪器，运用常规前处理酸水解法测定了鱼粉中16种氨基酸（OPA法测定15种）的含量。色氨酸在酸中分解，如采用酸水解法无法准确测定色氨酸的含量，必须采用碱水解法。半胱氨酸中的巯基会同OPA法中的2-巯基乙醇发生竞争性反应，所以OPA法无法测定半胱氨酸含量。针对这两种情况，本研究未检测鱼粉中色氨酸和半胱氨酸含量，在后续工作中将对这两种氨基酸的含量测定进一步研究。

有国家标准规定饲料中氨基酸的检测要使用氨基酸分析仪，不过氨基酸分析仪在价格上比高效液相色谱仪贵，对于需要出具公证数据、仲裁服务的检测机构可能会采用氨基酸分析仪测定氨基酸，其他企业实验室、研究机构等针对价格和多用性可能会考虑高效液相色谱仪测定氨基酸。使用者可根据不同需求选择合适的检测仪器和衍生方法。