利用乳酸菌发酵生产γ-氨基丁酸的研究进展

■同仲彬 杨 蕊 严昌国 辛宗瑞 文炳宪 李香子

（延边大学动物科学系，吉林延边 133002）

1950年，Roberts在哺乳动物脑灰质中首次发现γ-氨基丁酸（GABA），同年Awapara和Udenfriend也发现了这一物质。1966年，经Kmjevic等人研究且明确表明，GABA在哺乳动物大脑中模仿内源性神经递质工作。1975年，在第二届国际GABA专题讨论会，GABA被确认为哺乳动物神经中枢的一种抑制性递质。

γ-氨基丁酸，又名4-氨基丁酸、氨酪酸、哌啶酸，分子式为C4H9NO2，广泛存在于动物、植物和微生物中的一种四碳非蛋白质天然氨基酸。γ-氨基丁酸是一种白色或类白色结晶性粉末，微臭，微苦，无旋光性，极易溶于水，25℃时溶解度为130 g/100 ml，微溶于热乙醇，不溶于冷乙醇、苯、乙醚等常见有机溶剂，熔点202～204℃，熔化时分解生成吡咯烷酮和水。GABA是脊椎动物中枢神经系统中的一种重要的抑制性神经递质。研究表明，GABA具有增进食欲，促进消化，抗心率失常，降血压，镇静、抗惊厥，调节激素分泌等功能。

在哺乳动物体内GABA只存在于神经组织中，由谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）转化谷氨酸而成。研究发现，乳酸菌、大肠杆菌以及曲霉菌等都是具有GAD活性的微生物菌种，但是大肠杆菌在安全性方面存在隐患，乳酸菌被公认为是安全的益生菌，所以用乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)进行发酵生产GABA具有广阔的前景。

1 GABA的合成方法

目前，制备GABA的方法主要包括化学合成法和生物合成法，生物合成法又包括植物富集法和微生物发酵法。

1.1 化学合成法

化学合成法常用的有两种：一种是以邻苯二甲酰亚氨钾和γ-氯丁氰在180℃反应，产物与浓硫酸回流水解，再经结晶提纯而得；另外一种是以吡咯烷酮作为原料，经碳酸氢铵、氢氧化钙水解制得。最近，杨东元等采用一种新的方法，是以γ-丁内酯为起始原料，经氯化酯化反应，生成4-氯丁酸甲酯，再经氨解和皂化反应制得GABA，总收率达57.9%。运用化学合成法生产GABA虽然反应迅速，产品纯度高，但是在生产过程使用了危险溶剂，脱除产品中的有毒成分比较复杂且反应条件苛刻、能耗大、成本大，其主要被应用于化工领域，在食品和医药领域中应用仍存在一定的安全隐患。但是，随着人们对合成原料的不断研究更新，对合成工艺的不断完善，相信化学合成能够在安全性方面取得更大的突破。

1.2 植物富集法

植物富集主要包括两条途径：一条是转化途径(主要途径)，谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化合成GABA，是植物组织对外界条件应激代谢所生成(外界应激条件包括温度、压力、破碎、研磨、Ca2+浓度、H+浓度和氧浓度等)；另外一条是多胺降解，植物体内的多胺在二胺氧化酶的作用下，氧化脱氨形成H2O2、氨和4-氨基丁醛，然后4-氨基丁醛脱水形成1-吡咯啉，在吡咯啉脱氢酶催化作用下1-吡咯啉生成GABA。Komatsuzaki等研究稻米在浸泡3 h后，在35℃通气培养，稻米中GABA含量可达24.9 mg/100 g。Ta⁃kashi Iimurea等在150 mg/ml大麦麸中加入谷氨酸钠10 mmol，不加任何辅酶和缓冲液，在20℃下反应6 h，GABA浓度可达11.0 mmol，同样条件下运用小麦和米糠，GABA浓度分别为3.9 mmol和 0.8 mmol。近年来，我国许多研究人员也进行了植物（大豆、糙米、茶叶）富集GABA的研究。虽然天然产物提取法在操作上简单易行，但由于植物富集的GABA含量较低且分离提取比较困难，所以不适合规模化生产。

1.3 微生物发酵法

谷氨酸脱羧酶（glutamate decar⁃boxylase，GAD)是特异性的GABA合成酶，是GABA生物合成的限速酶。GAD已经被发现存在于多种细菌和真核微生物。大肠杆菌、曲霉菌、酵母菌、乳酸菌等微生物己被研究用于GABA生产。早期研究大多以大肠杆菌生物合成GABA为主，利用大肠杆菌产生的高活性GAD作用，将L-谷氨酸转化为GABA。Plokhov等、赵景联都利用大肠杆菌得到GA⁃BA。含有谷氨酸脱羧酶的曲霉也可用于GABA的生产，胡珊等从传统发酵食品中筛选获得一株γ-氨基丁酸高产红曲酶菌MXL-8，通过优化其培养基、发酵条件，最终使GABA产量达到了22.373 mg/ml；同样含有谷氨酸脱羧酶的酵母菌也可用于生产GABA，胡超等采用单因素及正交设计实验对酵母产γ-氨基丁酸（GA⁃BA）的培养基进行优化，在此培养条件下，摇瓶发酵可以获得GABA的产量为1.690 g/l。虽然大肠杆菌谷氨酸脱羧酶活性较高，生产GABA在得率上具有较大的优势，但是对于食品工业来说，以大肠杆菌生产GABA在安全卫生方面会存在较大的隐患。乳酸菌是具有极强GABA发酵能力且被国际公认的食品安全级微生物，可直接用于食品和医药产业，有望成为生物发酵GABA的最理想菌种。

2 分离的乳酸菌合成GABA研究概况

目前，各国学者已经筛选出了多株产GABA的乳酸菌菌株。Kom⁃atsuzaki等从传统发酵食品中分离得到一株乳酸菌Lactobacillus para⁃caseiNFRI 7415，其产GABA的能力达到了302 mmol/l；Kim S H等从韩国泡菜中分离到了产GABA的短乳杆菌，此菌培养48 h在MRS培养基中由50 g/l谷氨酸钠生成194 mM(约 20 000 mg/l)GABA，转化率达73%。Marina Diana等从西班牙干酪中筛选出四株产GABA较高的乳酸菌菌株，L.brevisCECT 8183、L.brevisCECT 8181、L.brevisCECT 8182、Lactic ssp lacticCECT 8184，对溶有20%的小麦粉进行发酵24 h，其中L.brevisCE⁃CT 8182产GABA浓度最大为(0.99±0.01)mmol/l。

国内利用乳酸菌发酵产GABA也有众多的研究，范杰等从酸菜、泡菜、奶酪等中筛选出一株短乳杆菌，其在含有10 g/l MSG的发酵培养基中产GABA能力达到5.72 g/l。周青等从不同泡菜中筛选出产GABA相对较高的植物乳杆菌，其在发酵培养基的产GABA量为1.261 g/l。龚福明等从云南传统发酵豆豉中筛选得到高产GABA的菌株L.plantarumYM-4-3，其在最适转化条件下（35℃，MSG含量3%，初始pH值6.0，静置厌氧发酵96 h)产GABA高达0.913 g/l。

从国内外学者的研究中，可以看到分离的不同乳酸菌产GABA的能力是不同的且差异比较显著，所以我们在选择的时候尽量选择产GABA能力强的菌株，并继续对其发酵环境（温度、pH值、氮源、碳源、无机盐、培养时间等）进行进一步研究。

3 产GABA乳酸菌发酵条件优化及诱变育种

3.1 发酵条件优化

对不同乳酸菌发酵条件优化的研究，不仅可以确定不同菌种的最适发酵条件，也可以节约成本，得出最优的产GABA方案，进一步运用于生产中。发酵条件优化包括培养基的组成，发酵温度、pH值的控制，谷氨酸加入量及加入时间的控制等。

冯宇等研究分离自酸菜的菌株Lactobacillus bre⁃visTCCC13007，对其以MRS为基础的GABA发酵培养基进行了优化，确定了葡萄糖、黄豆粉和玉米浆的最佳取值，优化后的培养基组成为(g/l)：葡萄糖21.80、黄豆粉36.30、玉米浆25.90、硫酸锰0.25、MSG 50，GABA产量为27.12 g/l，比液体MRS培养基的产量14.03 g/l提高了93.30%。范杰等以分离自泡菜的短乳杆菌(菌株Lacto⁃bacillus brevisSPFJ11412.1)为研究对象，得到的最佳培养基组成为：葡萄糖10.92 g/l、蛋白胨29.67 g/l、牛肉膏39.66 g/l、硫酸锰0.06 g/l、维生素B60.02 g/l。在优化后的培养基中添加3%的谷氨酸钠，33℃发酵72 h，发酵液中γ-氨基丁酸含量达到14.15 g/l，比原始的4.17 g/l提高了约240%。谢晓阳等选取前期研究分离鉴定的高产GABA的富锌短乳杆菌L.brevisBS2作为研究对象，通过15 L发酵罐进行分批及补料发酵实验，得出通过发酵44 h后向培养基中补加葡萄糖，培养过程中控制pH值在5.0左右，并且分别在32、56 h向培养基中补加添加谷氨酸钠，使发酵液中谷氨酸的含量达到20 g/l左右，发酵104 h GABA含量达33 g/l，产量提高2.5倍左右。Chunlong Peng等研究短乳杆菌CGMCC1306在发酵培养基(GYP)中控制pH值、温度和不同时段添加LMSG的产GABA量，得出先控制pH值5.0和温度35℃发酵32 h，后调整控制pH值4.5和温度40℃进行发酵，并且在32 h及56 h的时候添加L-MSG 20 g，发酵至72 h，GABA的浓度可以达到最大(526.33 mmol/l)，比单一控制pH值发酵产GABA浓度提高了32%。

3.2 诱变育种

为获得高产GABA乳酸菌菌株，研究表明，也可以通过物理诱变和化学诱变对菌株进行特定处理，把出发菌株改造成能在特定的条件下进行异常代谢，引导菌株生物合成的代谢途径朝人们所期望的方向发展，获得所需要的优质、高产菌种。

紫外线照射可使DNA分子形成嘧啶二聚体，二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，引起突变甚至死亡。亚硝基胍不仅可以增加DNA分子烷基侧链，从而改变DNA分子结构，而且可以在DNA双链间形成共价键，该共价键阻碍了DNA复制过程中双链的解开，从而引起突变。

李秀凉等对实验室保存的乳酸片球菌先后进行紫外线诱变、亚硝基胍诱变以及二者的复合诱变，发现紫外线诱变的最佳条件为18 W的紫外灯下，距离25 cm处，照射20 s；NTG诱变的较佳条件是终浓度为0.3 mg/ml，处理时间60 min；诱变后获得了1株突变株UN-27，连续传代10次，平均GABA的产量为5.017 g/l，是初始菌株（1.062 g/l）的4.72倍。葛菁萍等对实验室保存的6株乳酸菌进行筛选得到一株产GABA较高的菌株短乳杆菌HDBR-02经过UV诱变、NTG诱变和UV、NTG复合诱变，得到一株高产GABA的突变株F11，诱变后菌株GABA产量达到0.87 mmol/l，是出发菌株产量（0.21 mmol/l）的4倍多，最佳诱变剂量为紫外照射时间为13 s、距离24 cm，NTG浓度为0.6 mg/ml、诱变处理时间为30 min。并且对UV及NTG诱变效果进行比较，UV诱变所得菌株UV-1的GABA产量从初始菌株的0.21 mmol/l提高到0.42 mmol/l，产量提高了1倍，GABA增加量为0.21 mmol/l。 而再经NTG诱变之后，GABA产量达到 0.72 mmol/l，提高了大约3倍，由此可以直接看出NTG诱变的效果比UV诱变明显。吴非等从接入豆浆（大豆∶水=1∶8）的乳酸菌中筛选出一株产GABA较高的菌株保加利亚乳杆菌L2，在最佳紫外线照射条件下（照射时间为50 s），得到高产GABA突变菌株L2-4，其在豆浆中的GABA产量为1.394 g/l，在含有1%L-谷氨酸的改良MRS培养基中的GABA产量为4.235 g/l。

诱变育种虽然也可以提高菌株GABA产量，但此方法有利变异少，诱变的方向和性质不能控制，且易产生回复突变，工作量大，要想大幅度提高GABA产量，诱变育种还是有很大局限性的。

4 谷氨酸脱羧酶基因

通过研究培养基优化跟诱变育种可知，这两种方法虽然能够提高乳酸菌菌株产GABA的能力，但是操作过程麻烦，耗时，针对性不强，且GAD的表达受菌体代谢状态的控制，蛋白表达量及活力有限，对大幅度提高乳酸菌发酵产GABA的能力不显著，所以研究者渐渐开始将研究重点转向GABA限速酶——谷氨酸脱羧酶(GAD)。GAD是由酶蛋白与磷酸吡哆醛（PLP）组成的，PLP是GAD的辅基，它对GAD的活性发挥起着至关紧要的作用。研究谷氨酸脱羧酶基因，使生产GABA向着目的明确的方向发展。

乳酸菌活体细胞中存在谷氨酸脱羧酶(GAD)，随着近几年分子生物学技术的发展，研究人员开始研究通过克隆谷氨酸脱羧酶基因并导入其它菌株来表达，以这种方式来提高发酵产GABA的能力。

在GABA的基因工程生产方面，Park K B等将来源于L.brevis OPK-3的谷氨酸脱羧酶编码基因利用基因工程的手段转入到大肠杆菌中，并使其得到表达，而且使 GA⁃BA的产量高于野生型；Kook M C等将L.plantarumATCC 14917的GAD在L.sakei中表达，GABA产量提高了1.3倍左右；Chihiro T等将来源于大肠杆菌W3110的GAD在谷氨酸棒杆菌中表达，使最终GABA产量达12.37 g/l。

田灵芝等克隆了一株经过诱变筛选的具有较高谷氨酸脱羧酶活力植物乳杆菌GB 01-21的全基因组DNA的谷氨酸脱羧酶(GAD)编码基因lpgad，构建了一株重组大肠杆菌E.coliBL21/pET-28a-lpgad，并经乳糖诱导表达了有活性的重组蛋白GAD，在经1.5 g/l乳糖诱导8 h，重组菌粗酶液测得酶活力为331.56 U/ml，比酶活为8.53 U/mg，是出发菌株植物乳杆菌粗酶液酶活的4.24倍。李佑新等成功将其筛选的L.brevisLB85编码谷氨酸脱羧酶基因的四个PCR扩增片段 gadB1、gadB2、gadCB2 与gadRCB2连入大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体 pDXW-8、pDXW-9、pDXW-10中，并将于大肠杆菌中构建好的重组质粒利用电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌中，得到最优重组菌株ATCC 13032/pDXW-10/gadRCB2，其在葡萄糖浓度为5%、添加 2或 3次尿素、250 ml的三角瓶中装有10 ml的发酵培养基积累的GABA较多，GABA的产量最终可达到2.41 g/l。

由于基因工程针对性和可控制性强，所以国内外学者对于不管是乳酸菌还是其他有益的微生物生产GABA的研究重点都已经转移到了研究谷氨酸脱羧酶基因上，这对以后大量生产GABA是非常有益的。但由于不同微生物来源的GAD不仅在分子量大小上存在差异,在酶学性质方面也存在一定的差异，主要表现在pH值和温度上，所以在研究谷氨酸脱羧酶基因时，应先了解各个微生物酶的酶学性质，以便更好地利用基因工程技术生产GABA。

5 展望

本文简单地阐述了几种合成GABA的方法，重点论述了利用乳酸菌发酵生产γ-氨基丁酸的研究，并对其优缺点作了简要分析。通过比较，利用基因工程生产GABA的量虽然不高，但与初始菌株相比，提高倍数也是喜人的，而且此方法也可以大大降低生产成本。在以后的研究中，这几种方法也许可以综合起来以最经济的方法生产最多的GABA。

（参考文献56篇，刊略，需者可函索）