自体DC-CIK细胞联合索拉非尼治疗晚期肾癌的临床效果

艾月琴 赵 华 江龙委 贾绍昌

解放军第八一医院肿瘤生物治疗科，江苏南京 210002

肾癌是一种严重危害人类健康的恶性疾病。大多数晚期肾癌对放化疗不敏感，且预后较差[1]。细胞免疫治疗对肿瘤的生物治疗取得了良好效果，并逐渐成为肿瘤治疗的重要手段之一。近年细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer，CIK）的免疫功能得到广泛研究。CIK 细胞作为一种新型的广谱抗肿瘤免疫细胞，不仅具有强大的广谱抗肿瘤效应，而且可以调节增强肿瘤患者的免疫功能[2-5]。树突状细胞（dendritic cells，DC）是特异性免疫的始动者，能将抗原呈递给免疫效应细胞，据文献报道可以增强CIK 细胞的细胞毒活性[6-7]。 索拉菲尼（Sorafenib）是一种选择性抑制肿瘤细胞增殖和组织中肿瘤学血管生成的多靶点抗肿瘤药物，可同时抑制丝氨酸/苏氨酸和受体酪氨酸激酶，具有良好的抗肿瘤活性[8]。本研究小组进行了自体DCCIK 细胞联合索拉非尼治疗24 例晚期肾癌患者，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2011 年12 月～2014 年3 月解放军第八一医院行自体DC-CIK 联合索拉菲尼治疗的晚期肾癌患者24 例。所有患者均经病理学确诊为肾癌，其中透明细胞癌18 例，颗粒细胞癌4 例，乳头状细胞癌2 例。24 例患者中男14 例，女10 例，年龄27～71 岁，中位年龄为57 岁。 所有患者均为晚期肾癌， 其中肺转移22 例，肝转移4 例，骨转移14 例，脑转移2 例，其他12 例。 其中15 例为术后复发转移，病灶转移均2 处及以上。 卡氏评分（KPS）＜80 分16 例，≥80 分8 例。病例排除标准：怀孕及哺乳期妇女；患有自身免疫性疾病；感染活动状态；严重凝血异常；既往有生物制品过敏者。所有临床试验程序均经医院伦理委员会审查批准，全部受试患者均签署自体免疫细胞治疗知情同意书。

1.2 DC 及CIK 细胞的制备及回输方法

对患者行单个核细胞采集， 采集终产品经Ficoll密度梯度离心法离心， 吸取中间白色分层， 洗涤、计数，铺入75 cm2培养瓶，加X-VIVO 培养液至浓度为2×106/mL，摇匀，平放于37℃、5% CO2细胞培养箱培养1～2 h，待贴壁细胞贴壁后，吸取上清，将其中的悬浮细胞用于CIK 培养， 剩下的贴壁细胞进行DC 培养。DC 制备：在贴壁细胞瓶中加入含重组人粒细胞单核细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）（500 U/mL）及重组人白细胞介素4（rhIL-4）（10 ng/mL）的X-VIVO 培养液，置于细胞培养箱中继续培养。第3 天、第5 天半量换液，第6 天加入负荷抗原（与患者病理组织学相近的同种异体肿瘤细胞株裂解物）， 第7 天加入肿瘤坏死因子α（TNF-α）（500 U/mL），第8 天收获肿瘤抗原致敏的DC 疫苗，-80℃冰箱冻存。 治疗当天将DC 细胞复苏， 复苏的DC 细胞置于20 mL 生理盐水中备用。 CIK 制备： 将悬浮细胞按1×106/mL 置于含GTT551 培养液的培养瓶中， 内含终浓度1000 U/mL 的重组人γ 干扰素（rhIFN-γ）；孵育24 h 后加入终浓度500 U/mL 的重组人白细胞介素2（rhIL-2）和50 ng/mL的anti-CD3 mAb 继续培养，每隔2 d 补液1 次，保持细胞密度在（1～2）×106/mL，适时分瓶培养。 观察细胞的扩增数量、状态及成熟度，在细胞成熟后收集细胞。收集的CIK 细胞置于100 mL 生理盐水中备用。

1.3 治疗方法

患者行单个核细胞采集后第2 天行索拉非尼治疗，400 mg/次，2 次/d， 若无明显不良反应则连续服用。 外周血单个核细胞（PBMC）采集后经实验室培养1 周后进行DC 细胞淋巴结区皮下注射，1 次/周，共4 次；PBMC 采集后经实验室培养8～10 d，进行CIK 细胞静脉回输，隔天1 次，共3 次。 每次回输DC 细胞不少于1×107，CIK 细胞不少于1×109。 4 次DC 治疗加3 次CIK 治疗为1 个周期。 每间隔1 个月重复DC-CIK 细胞治疗1 个周期， 每位患者至少行1 个周期的DCCIK 细胞治疗。 治疗期间白细胞计数＜3×109/L 或肝功能异常者停药8 周后进行评价，对药物反应性好及可耐受者停药休息2～4 周继续下1 个周期治疗。在治疗前1 个月内行CT 检查，每2 个月行CT 检查1 次。

1.4 淋巴细胞亚群检测

每次DC-CIK 治疗前及治疗结束后检测患者的外周抗凝血， 分三组加入流式抗体， 第一组CD3-ECD、CD4-PC5、CD8-FITC；第二组CD4-PC5、CD25-PE；孵育20 min 后加入红细胞裂解液继续孵育10 min；低速离心机中离心，离心机半径13.5 cm，转速3000 r/min，离心5 min 后PBS 洗涤2 次，制成单细胞悬液后上机检测，检测结果用CXP（v2.1）软件分析。不同淋巴细胞亚群的标记如下：总T 细胞（CD3+）、辅助性T 细胞Th （CD3+CD4+）、 细胞毒性T 细胞Tc（CD3+CD8+）、调节性T 细胞Treg（CD4+CD25+）。

1.5 疗效与安全性评价

在患者接受完最后1 次细胞治疗后1 个月进行免疫反应及临床疗效评估， 在治疗后3 个月再次评估，之后每3～6 个月复查评估。 近期疗效评估按实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）分为完全缓解（complete remission，CR）、部分缓解（partial remission，PR）、病情稳定（stable disease，SD）和疾病进展（progressive disease，PD），患者至少4 周以后进行疗效确认。 以CR+PR 计算治疗有效率（response rate，RR），以CR+PR+SD 计算疾病控制率（disease control rate，DCR）。 生活质量评价根据患者KPS 评分：KPS 增加≥10 分为改善；变化＜10 分为稳定，减少≥10 分为降低。 不良反应根据美国国立癌症研究所《常见不良反应标准》（NCI-CTCAE v4.0）进行判定。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行分析。 计数资料采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（s）表示，两组间比较采用t 检验（正态分布时）或者Wilcoxon 秩和检验（非正态分布时），同一样本治疗前后比较采用配对t 检验。 以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC 和CIK 培养结果

经流式细胞仪检测，DC 及CIK 细胞表型符合DC 及CIK 的特征。CIK 细胞在第3 天后开始增殖，第5～6 天快速增长。 在回输入患者体内前，收获CIK 细胞分析其表型及细胞毒性。CIK 细胞效靶比为5∶1 时，CIK 细胞对MCF-7 的细胞毒活性为50.6%， 而正常外周单核细胞的细胞毒性仅为9.4%，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

2.2 免疫治疗前后患者外周血免疫学指标变化

24 例患者中，19 例患者行1 个周期细胞治疗，4 例患者行2 个周期细胞治疗，1 例患者行3 个周期细胞治疗。索拉非尼联合自体DC-CIK 细胞治疗后与治疗前比较，患者外周血淋巴细胞亚群检测示，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明显上升，而CD8+T 淋巴细胞比例、CD4+CD25+Treg 细胞比例下降明显，差异有统计学意义（P ＜0.05）。 见表1。

表1 患者治疗前后外周血淋巴细胞亚群的变化（%，s）

表1 患者治疗前后外周血淋巴细胞亚群的变化（%，s）

时间 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ CD4+CD25+治疗前治疗后P 值55.97±11.71 67.80±8.50 0.018 30.18±8.33 40.40±7.71 0.021 25.41±6.22 17.34±4.52 0.005 1.08±0.60 1.89±0.53 0.011 7.12±1.71 4.57±1.56 0.034

2.3 临床疗效观察

所有患者随访10～40 个月。24 例患者中CR 2 例（8.3%），PR 4 例（16.7%），SD 15 例（62.5%），PD 3 例（12.5%）；RR 为25.0%，DCR 为87.5%。随访截止日期为2015 年4 月，其中6 例死亡，18 例存活。

2.4 生活质量

部分患者经DC、CIK 细胞免疫治疗后自觉生活质量有所提升，具体表现为食欲增强、睡眠改善、疼痛减轻、体力较前好转、索拉非尼治疗的不良反应减轻。所有患者治疗前平均KPS 评分为（56.5±7.0）分，治疗后平均KPS 评分为（75.7±7.3）分，治疗前后差异有统计学意义（P ＜0.05）。治疗后生活质量改善14 例（58.3%），稳定6 例（25.0%），降低4 例（16.7%）。

2.5 不良反应

DC-CIK 细胞免疫治疗后，不良反应一般出现在回输后1～2 h。 其中发热12 例，持续时间2～8 h，自行缓解7 例，5 例给予药物对症处理后缓解；皮疹16 例，均为1～2 级；血压升高10 例；Ⅰ度转氨酶升高1 例；Ⅱ度腹泻2 例。 所有不良反应均未达3～4 级。

3 讨论

肾癌是起源于肾实质中泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，是一种严重危害人类健康的恶性疾病。 目前为止， 根治性肾癌手术仍为治疗肾癌的主要方法，但并非所有肾癌患者均可手术根治。 统计表明，患者中确诊时发生远处转移的约占25%，术后患者出现复发或转移的患者占30%，且大多数转移性肾癌对放化疗不敏感，预后较差。 细胞免疫治疗及分子靶向药物对肿瘤的生物治疗取得了良好效果，并逐渐成为肾癌治疗的重要手段之一[9-10]。

索拉菲尼是由德国Bayer 公司研发的靶向抗肿瘤药物，于2005 年获美国FDA 批准用于治疗晚期肾细胞癌。 索拉菲尼是首个口服多激酶抑制剂，靶向作用于肿瘤细胞以及肿瘤血管内丝氨酸/苏氨酸激酶受体和酪氨酸激酶受体，具有双重抗肿瘤作用，既能通过抑制Raf/MEK/ERK 信号传导通道直接抑制肿瘤生长，又能通过抑制与新生血管生成和肿瘤生长有关的酪氨酸激酶受体的活性， 阻断肿瘤新生血管的生成，间接抑制肿瘤细胞生长[11-12]。 在多个临床及临床前试验中均显示，索拉菲尼对晚期肾癌具有良好的治疗效果，是晚期肾癌治疗的重大进展[13-15]。但是索拉非尼单一治疗肾癌仅短期内获得较好的治疗效果，长期生存时间并未获得明显改善。 因此，索拉非尼需要与其他的治疗方法联合，以期提高晚期肾癌的疗效。

细胞免疫治疗是一种新型的肿瘤治疗手段，DC及CIK 是其中重要的两种细胞。 DC 通过识别、摄取、提呈肿瘤抗原，可激活特异性抗肿瘤免疫[16]。CIK 是人工培育的一种异质性的免疫细胞， 既具有T 细胞特性，也具有NK 细胞特性，具有广谱抗肿瘤作用[17-18]。本研究对24 例晚期肾癌患者给予自体DC-CIK 细胞联合索拉非尼治疗的效果进行了探讨。 结果显示24例患者中CR 2 例（8.3%），PR 4 例（16.7%），SD 15 例（62.5%），PD 3 例（12.5%）；RR 为25.0%，DCR 为87.5%。这证明索拉菲尼联合细胞免疫治疗能使患者获得一定的临床获益。

肿瘤最终得以发展，一方面说明机体的免疫功能出现了缺陷， 诱导的免疫反应不足以对抗肿瘤细胞；另一方面也与肿瘤细胞自身的各种免疫逃逸有关。研究显示，机体内淋巴细胞的比例与机体免疫功能息息相关， 其中淋巴细胞亚群中CD3+总T 细胞比例及CD4+/CD8+比值与肿瘤患者的抗肿瘤免疫功能相关，CD3+T 细胞比例、CD4+T 细胞比例及CD4+/CD8+比值与肿瘤的病变程度呈负相关。同时，CD4+CD25+Treg 细胞是免疫负性细胞，具有抑制抗肿瘤免疫的功能[19-21]。本研究结果显示， 经细胞治疗联合索拉菲尼治疗后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明显上升， 而CD8+T 淋巴细胞比例、CD4+CD25+Treg 细胞比例下降明显，证明联合治疗能加强患者抗肿瘤免疫功能。

DC-CIK 治疗的安全性较高，与其相关的不良反应一般出现在回输1～2 h。其中发热12 例，皮疹16 例，血压升高10 例，所有不良反应均未达3～4 级，提示细胞免疫治疗的安全性有所保障。

综上所述，自体DC-CIK 细胞联合索拉非尼治疗晚期肾癌，能够使患者获得一定的临床获益，改善患者免疫功能，并有效改善患者的生活质量，且发生的不良反应大都在可耐受范围， 具有临床使用价值，值得进一步扩大样本研究证实。

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