一株多氯联苯降解菌的分离鉴定及其生长条件优化

罗筱枭， 彭书传， 王 进， 方 丽， 岳正波， 吴 克

（1.合肥工业大学 资源与环境工程学院，安徽 合肥 230009；2.合肥学院 应用酶学与工程重点实验室，安徽 合肥 230022）

一株多氯联苯降解菌的分离鉴定及其生长条件优化

罗筱枭1， 彭书传1， 王 进1， 方 丽1， 岳正波1， 吴 克2

（1.合肥工业大学 资源与环境工程学院，安徽 合肥 230009；2.合肥学院 应用酶学与工程重点实验室，安徽 合肥 230022）

文章从垃圾渗滤液中分离得到一株具有降解多氯联苯能力的菌株，对其进行16s r DNA序列分析，确定为枯草杆菌（Bacillus subtilis），编号为WF1。实验考查了该菌的生长和降解特性，分别研究p H值、温度、装液量等因素对菌株降解能力的影响；并通过正交试验对其生长条件进行优化，结果表明菌株适宜生长条件与降解条件基本一致。其中p H值为最主要影响因素，温度和摇床转速为次要因素，装液量为不重要因素。p H值7.0、温度35℃、摇床转速150 r／min为菌株的适宜生长条件。

多氯联苯；枯草杆菌WF1；正交试验

多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）作为电容器和变压器内的绝缘介质、润滑剂、增塑剂、杀虫剂、黏合剂、复写纸、有机稀释剂以及阻燃剂等［1］的主要成分，由于其持久性、生物蓄积性、远距离迁移性和高毒性，对人类的生殖系统、神经系统和免疫系统产生巨大的危害。国家规定对含多氯联苯废物要进行单独处理处置，但目前由于垃圾分类没有很好地实施，导致只针对含有害多氯联苯废物的电容器、变压器等进行了单独封存或焚烧，而一部分含多氯联苯废弃物与普通垃圾混合堆放在垃圾填埋场。因此，废弃物中的PCBs成分直接经过雨水的冲刷或者间接通过降尘等进入到垃圾渗滤液中［2－5］。目前关于PCBs的处理方式主要有封存填埋、催化降解、高温焚烧、热处理和微生物降解等［6－8］。其中封存法使封存点的环境风险逐年增加，填埋法只适用于处置含量少的PCBs的固体废弃物，也存在环境风险，且目前被封存的PCBs大部分都已到期，对封存点的土壤和地下水造成污染隐患［9］。高温焚烧法分解效率高但设备昂贵，操作管理过程存在困难，另外灰烬中含有未分解的PCBs，容易造成二次污染，当处理温度过低时，二恶英生成的危险性也随之增加。相比较而言，微生物降解法具有廉价、无二次污染和原位修复等特点，因此最具潜力［10］。

对多氯联苯的好氧微生物降解的研究一直是多氯联苯污染环境生物修复的热点问题。到目前为止，已经有几十种好氧降解菌株从PCBs污染源中被筛选出来，大多数为革兰氏阴性菌［11－13］，如Sphingomonas、Burkhoderia、Pesudomonas、Comamonas等。但是，由于垃圾渗滤液成分极其复杂，直接从垃圾渗滤液中分离纯化得到多氯联苯降解菌的报道较少，因此，本文利用联苯为底物驯化其降解PCBs的能力，采用富集分离的培养方式从垃圾渗滤液中获得一株能以PCBs为唯一碳源生长的菌株，并对其生长和降解特性进行了初步分析，以期为其在生物修复中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 微生物的来源与培养基

微生物的来源为合肥龙泉山垃圾填埋场垃圾渗滤液。

富集培养基成分为蛋白胨10 g／L、牛肉膏5 g／L、NaCl 5 g／L。

无机 盐 培 养 基 成 分 为 KH2PO40.5 g／L、K2HPO40.5 g／L、MgSO40.2 g／L、CaCl20.1 g／L、NaCl 0.2g／L、（NH4）2SO41.0 g／L，联苯0.5 g／L。固体培养基中加入2%琼脂。

降 解 培 养 基 成 分 为 KH2PO40.5 g／L、K2HPO40.5 g／L、MgSO40.2 g／L、CaCl20.1 g／L、NaCl 0.2 g／L、（NH4）2SO41.0 g／L、PCB70（2，3’，4’，5－四氯联苯）－正己烷溶液0.5 g／L。

培养基（不加联苯）均调节p H值至7.0，并在121℃、0.1 MPa下灭菌20 min后使用，联苯经过紫外灭菌后再加入到培养基中。

1.2 PCBs降解菌株筛选

将采取的水样按照10%接种量接种至富集培养基中，在35℃、150 r／min的摇床中培养，得到富集培养对象占优势的微生物混养物。取1 m L富集菌液加入到100 m L以联苯（采用灭菌的联苯－乙酸乙酯溶液喷洒于表面）作为唯一碳源的无机盐培养基中，每5～7 d按10%接种量转移至新鲜的无机培养基中［14］。最后取培养液按照10－1、10－2、10－3逐级梯度稀释菌液，无菌操作下分别吸取0.2 m L不同梯度的稀释菌液涂布于固体无机盐培养基平板上，倒置培养于35℃恒温培养箱，培养至平板长出肉眼可见的菌落。

选取平板上生长的典型单一菌落，至富集培养基中培养，培养后再经多次平板划线，直至分离得到纯的单菌落。

1.3 菌株鉴定

1.3.1 细胞观察

样品经过固定化处理和革兰氏染色后进行油镜观察［15］。用戊二醛固定乙醇脱水，真空干燥和表面喷金后用S－4800扫描式电子显微镜进行形态观察及电镜摄影。

1.3.2 细菌16S r DNA测序和构建系统发育树

利用分子生物学手段对菌株进行鉴定。以基因组DNA为模板PCR扩增16S r DNA，扩增引物采 用 细 菌 通 用 引 物 F27 （5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’）和 R1492 （5’－GGTTACCTTGTTACGACTT－3’）。

PCR反应体系选用50μL反应体系：引物1μL；引物2μL；d NTP 1μL，Pfu Buffer 5μL，Pfu酶0.25μL，加水至50μL。

PCR扩增条件：98℃5 min；95℃35 s，55℃35 s，72℃1 min，35个循环，延伸4 min。

扩增的PCR产物在17%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，经 UNIQ－10PCR Product Purification Kit（Sang on and NSBC）纯化。将纯化的PCR产物连接到载体p UCm－T上，提取有16S r DNA插入的质粒并测序，序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。将测序结果用Blast软件与GenBank中已登录的16S r DNA序列进行同源性比较。

1.4 菌株的优化培养

1.4.1 菌珠生长曲线测定

将菌株接入富集培养基内，置于摇床内在35℃、150 r／min条件下，富集培养3 d。再取1 m L富集菌液分别接种于8个含100 m L降解培养基的250 m L锥形瓶中，并置于摇床中35℃、150 r／min培养；于无菌操作条件下定期取5 m L菌液测定菌体干质量。

1.4.2 PCB70降解率的影响因素分析

（1）p H值对PCB70降解率的影响。调节培养基p H 值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，分别接入5%新鲜菌液，35℃、150 r／min下培养，测定降解率，确定最佳p H值。

（2）温度对PCB70降解率的影响。向降解培养基中接入5%新鲜菌液，分别置于15、25、35、45℃下150 r／min培养，测定降解率，确定最佳温度。

（3）装液量对PCB70降解率的影响。在250 m L三角瓶中分别加入50、75、100、125 m L降解培养基，接入5%新鲜菌液，35℃、150 r／min下培养，测定降解率，确定最佳装液量。

（4）底物质量浓度对PCB70降解率的影响。以PCB70（2，3’，4’，5－四氯联苯）为降解底物，配制 PCB70质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg／L的降解培养基，调节p H 值为7.0，分别接入5%新鲜菌液，35℃、150 r／min下培养，测定降解率，确定最佳底物质量浓度。

1.4.3 正交试验设计

选取影响 WF1生长的4个因素——温度、p H值、装液量及摇床转速，将菌株按不同因素不同水平条件培养，48 h后测定其在600 nm处的吸光度，平行测定3次，取平均值，考察菌株在不同条件下的生长状况，探究其适宜的生长条件。

1.4.4 PCB70降解率测定

取样加入（NH4）2SO4破乳，加入正己烷萃取，摇床震荡10 min，静置30 min后以5 000 r／min离心5 min，取上层正己烷相上机分析。

气相色谱分析条件：色谱柱为 Wonda CAP 0.25 mm×0.25μm×30 m；载气为高纯氮气，进样口温度为150℃；检测器温度为260℃；进样体积为1μL，无分流进样；柱箱升温程序如下：初始温度为150℃，保持4 min，以10℃／min升至320 ℃，保持10 min［16－18］。

比较空白组和降解组相同保留时间的峰面积比值，计算降解率。

2 结果与讨论

2.1 菌株鉴定与菌株WF1生长曲线的测定

本实验经富集、分离纯化得到一株降解联苯的纯菌株WF1，菌株在固体培养基上为乳白色，菌落为圆形，表面光滑，不透明，菌体为杆状，细胞长度约1.2～2.6μm。革兰氏染色为阳性，扫描电镜如图1所示。

菌株WF1生长曲线如图2所示。多氯联苯降解菌株WF1的生长经过1 d多的迟滞期后进入对数生长期，经过6 d的培养后由于培养基中的营养物质不断地被消耗掉以及菌株WF1新陈代谢产生的毒性物质的积累等因素的影响，WF1的生长进入衰亡期。

图1 菌株WF1的扫描电镜照片

图2 菌株WF1生长曲线

将16S r DNA测序结果，与已有的Blast数据进行序列分析和同源性比较，找出了与该菌株有较好同源性的基因，构建了系统发育树，如图3所示。

从图3可以看出，分离得到的菌株WF1与枯草杆菌（Bacillus subtilis）多个菌株的同源性高达99%以上，综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，该菌株属于枯草杆菌（Bacillus subtilis）。

目前研究报道有多种微生物能够降解PCBs［13，19－26］。其中 Acinetobacter sp.P6在联苯为碳源的生长体系中可以降解Aroclor 1254中40个大峰中的25个［27］；Alcaligenes eutrophus.H850能利用联苯和2－氯联苯为唯一碳源生长，并且在休眠细胞体系中可以降解4氯、5氯和部分6氯取代的多氯联苯［28］；Alcaligenes sp.JB1在好氧恒化反应器可降解4～6氯取代的PCBs，而休眠细胞只能降解最多4氯的PCBs［29］；Burkholderia xenovorans LB400降解底物范围宽，在休眠体系中对不同类型的2～6氯的PCBs都能 降解［30］。

图3 以16S rDNA同源性为基础的系统发育树

2.2 对PCB70降解率的影响因素分析

p H值、温度、装液量对PCB降解率的影响分析曲线如图4所示。

2.2.1 p H值对PCB70降解率的影响

由图4a可见，p H 值为7.0时，菌株对PCB70降解率最高，最高达82.65%。p H值为6.5和7.5时，PCB70降解率比p H 值为7.0时低，在第9天降解率分别为65.75%和62.56%。而当p H值为5.5和8.0时，PCB70降解率最低。因为溶液呈酸性或碱性时，菌株生长均受到抑制，影响降解速率。因此。p H值为6.5～7.5时，降解效果好。

图4 p H值、温度和装液量对PCB70降解率的影响

每种微生物都有其生长繁殖的最适p H值和一定的p H范围。在最适范围内酶活性最高，如果其他条件适合，微生物的生长速率也最高。如果p H值不合适，不但影响菌体的正常生长，而且还会改变微生物产酶的活力和种类。过酸或过碱可导致细胞死亡，这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关［31］。

2.2.2 温度对PCB70降解率的影响

由图4b可知，在15～35℃时，随着温度的升高，WF1菌株对PCB70的降解率也随之升高，当温度升高到35℃时，降解率达到最大，第5天达到69.37%，第6天达到82.43%。当温度达到45℃时降解率显著下降，这是因为菌株在超过45℃时活性很低或不能生长。因此确定该菌株在25～35℃时PCB70降解率最佳。

温度是影响微生物生长与存活的最重要的因素之一。它对机体的影响主要表现在2个方面：一方面随着温度的上升，细胞中生物化学反应速度和生长速度加快；另一方面，机体的重要组成成分如蛋白质和核酸等对温度都很敏感，随着温度的升高而可能造成不可逆的破坏。因而只有在一定温度范围内，机体的代谢活动与生长繁殖才能随着温度的升高而增加，当温度上升到一定程度，便开始对机体产生不利影响，如继续升高，则细胞功能急剧下降以致死亡［31］。

2.2.3 装液量对PCB70降解率的影响

如图4c所示，PCB70降解率随着装液量的增加而成降低的趋势。装液量为50、75、100 m L时，PCB70降解率最高分别达89.63%、83.82%和69.71%。这是因为WF1为好氧型菌，在降解PCB70过程中对溶解氧量的要求较高，装液量少、溶氧量高有利于其生长及对PCB70的降解［32］。装液量为125 m L时，PCB70降解率最高只有46.06%。因为装液量为125 m L时三角瓶培养基上空的氧气含量减少，再加上三角瓶本身的质量过大，固定摇床转速为150 r／min，液体培养基在振荡器中不易被摇晃均匀，导致菌体不能完全利用液体培养基中的营养物质，使得降解率降低。

反应器的体积和摇床转速一定时，装液量越大，营养物质总量越大，所能供养的菌种总量越大，降解率也越高；但装液量越大，单位溶液中的溶氧量越少，从而不利于好氧微生物的生长，降解率也随之降低［33］。因此，菌株 WF1的装液量选择100 m L／250 m L三角瓶以下为最佳。

2.2.4 底物质量浓度对PCB70降解率的影响

PCB70是本实验菌株 WF1的碳源，在一定的质量浓度范围内，PCB70作为营养物质被分解，能够促进微生物的生长和繁殖，另一方面，PCB70又可以作为菌株产PCB70降解酶的底物，诱导菌株产PCB70降解酶，因而提高了降解率。而PCB70质量浓度过高产生的大量有毒物质会对菌株产生毒害作用，影响其降解率［34］。

底物质量浓度对PCB70降解率的影响如图5所示。WF1在PCB70质量浓度为0.1～0.8 mg／L范围内均能生长。在0.2 mg／L 时，WF1的降解效果最好，为72.73%。在底物质量浓度为0.1、0.4 mg／L时，降解率均为64.82%。随着PCB70质量浓度由0.4 mg／L逐渐提高到1.0 mg／L时，其降解率也逐渐降低。特别地，当PCB70质量浓度高达1.0 mg／L时，降解率仅为43.48%。因为PCB70质量浓度过高，超过了菌株的忍受极限，对微生物的毒害作用增大，甚至有致死作用，导致菌体数量下降，从而造成了降解率的降低。因此确定在底物质量浓度为0.1～0.2 mg／L时WF1对PCB70的降解率最好。

图5 底物质量浓度对PCB70降解率的影响

2.3 菌株WF1的生长条件优化

正交试验的结果及分析见表1所列。由p H值、温度、装液量、摇床转速4个因素的极差，可得知这4个影响因素对菌株生长的重要性依次为：p H值＞温度＞转速＞装液量。

表1 正交试验设计与结果分析

由表1中极差R可以看出，p H值为最主要因素，温度和摇床转速为次要因素，装液量为不重要因素。在p H值为7.0的条件下，菌株WF1生长得最好。温度是影响微生物酶活性的重要因素，也是微生物生长条件的关键因素，由试验结果可知，WF1的生长状况在30℃和35℃时较好，并且在35℃时，OD600平均值最高，达到0.71。转速主要决定了培养基中碳源的利用率以及菌株与空气的充分接触，但是转速不宜过高，过高使得联苯无法吸附在锥形瓶瓶壁上，微生物也就无法附着在联苯上，这就可能导致菌株的生长状况反而较差。转速为150 r／min的4组试验结果的OD600平均值最高为0.67，其次是转速为100 r／min的4组，OD600平均值为0.64，而转速为0、50 r／min的8组试验OD600平均值明显变小，可见该菌的生长需要通过搅拌与空气充分接触。装液量影响供微生物生长的氧气含量，从正交试验的结果来看，在装液量分别为30、50、100、150 m L时，WF1生长情况差别很小。综上所述，适宜菌株 WF1生长的优化条件为：p H值7.0、温度35℃和摇床转速150 r／min。

3 结 论

（1）本研究从垃圾渗滤液中筛选出一株以联苯为唯一碳源生长的纯菌株WF1，此菌株经革兰氏染色，为Gram＋，经SEM扫描，细胞呈杆状（长1.2～2.6μm）；将16Sr DNA 测序结果与已有的Blast数据进行了序列分析和同源性比较，找出了与该菌株有较好同源性的基因，构建了系统发育树，最终将其鉴定为枯草杆菌。

（2）纯菌株WF1对PCB70的降解过程受环境条件的影响，在35℃、p H 值为6.5～7.5、装液量100 m L／250 m L以下、PCB70质量浓度为0.1～0.2 mg／L、转速为150 r／min的条件下，降解率较高；通过正交试验优化得到菌株 WF1的适宜生长条件如下：p H值为7.0，温度为35℃，转速为150 r／min。研究表明菌株的良好降解条件与适宜生长条件基本一致。

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Isolation，identification and growth optimization of a PCBs－degrading strain

LUO Xiao－xiao1， PENG Shu－chuan1， WANG Jin1，FANG Li1， YUE Zheng－bo1， WU Ke2

（1.School of Resources and Environmental Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China；2.Key Laboratory of Applied Enzymology and Engineering，Hefei University，Hefei 230022，China）

A polychlorinated biphenyls（PCBs）－degrading bacterium was isolated from landfill leachate.The strain，named as WF1，belongs to Bacillus subtilis based on 16s r DNA sequence analysis.In order to investigate the growth and degradation characteristics of the bacterium，the factors such as p H value，temperature and liquid volume which affected PCBs－degrading ability of the strain were studied.The growth condition was optimized by the orthogonal tests.It was showed that the suitable growth situation for strain WF1 was coincident with the optimal degradation condition of PCB70.The p H value was the most important factor，temperature and rotation speed were second，while liquid volume was not important.The optimal growth condition for the strain was p H value of 7.0，temperature of 35℃and rotation speed of 150 r／min.

polychlorinated biphenyls（PCBs）；Bacillus subtilis WF1；orthogonal test

X172

A

1003－5060（2015）02－0232－07

10.3969／j.issn.1003－5060.2015.02.020

2014－02－17；

2014－03－31

国家自然科学基金资助项目（41372347）；安徽省科技攻关计划资助项目（12010402100）

罗筱枭（1991－），女，浙江台州人，合肥工业大学硕士生；

彭书传（1964－），男，安徽六安人，合肥工业大学教授，硕士生导师.

（责任编辑 张淑艳）