对氧磷酶基因多态性对急性有机磷中毒致多脏器功能障碍的影响

周宁 姚为学 李志文 陈粤明 苏耿 柯道 梁金明

急性有机磷农药中毒(acute organophorus pesticides poisoning，AOPP)起病急，病情变化快，治疗不及时易导致患者因昏迷和多器官功能功能障碍综合征(MODS)而死亡；主要发病机制是抑制乙酰胆碱酯酶(AchE)，导致AchE蓄积，引起胆碱能神经传导功能障碍，出现一系列中毒症状[1]。MODS是其主要的并发症和病死原因之一。因此早期评估AOPP后MODS的发生、发展对临床抢救AOPP有重要意义。本研究通过检测AOPP患者的对氧磷酶1(paraoxonase-1，PON-1)基因多态性，回顾性分析PON-1基因多态性对SOFA、APACHEII评分及MODS发生率的影响，探讨PON-1基因多态性对AOPP致多脏器功能障碍的影响和相关性。

资料与方法

一、临床资料

对2011年1月至2014年10月广东省湛江中心人民医院收治的AOPP中毒患者140例进行回顾性分析，其中男性63例，女性77例；年龄14～65岁。甲胺磷53例，毒死蜱38例，对硫磷(1605)32例，敌敌畏27例。入选MODS标准参照2007年北京市科委MODS课题组的诊断标准[1]。排除有糖尿病、肿瘤、病毒性肝炎患者、脑血管意外、大手术、急性心肌梗死、感染性休克等所致应激状态的患者。

二、方法

1.治疗方法：(1)常规清洁洗胃；(2)特效解毒剂的应用，包括胆碱能神经抑制剂阿托品和肟类复能剂氯磷定，用药中强调早期、足量、反复给药及个体化原则，当阿托品化后及时减量维持；(3)积极的对症治疗措施，严密观察呼吸功能，如出现呼吸衰竭，立即给予气管插管机械通气，同时注意维持酸碱平衡。

2.基因多态性分析：采集AOPP患者的血液标本，快速分离血清，分装后保存在-70℃的冰箱中，等待检测。乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血分装后保存在-70℃的冰箱中，等待检测。使用盐析法提取0.5 mL EDTA抗凝血中的基因组DNA，PCR-限制性片段长度多态性分析PON-1基因192位点的基因型。按文献方法[2]对PON-1基因192位点进行扩增，引物序列为：5’-TATTGTTGCTGTGGGACC TGAG-3’, 5’-CACGCTAAACCCAAATACATCTC-3’(上海生工)，PCR反应体系于95℃变性5 min后，按程序(95℃变性30 s→60℃退火30 s→72℃延伸30 s)扩增35个循环，最后于72℃延伸10 min。限制性内切酶Alw44 I在37℃孵育4 h以消化反应体系，使用质量分数为3%的低电渗琼脂糖凝胶电泳检测消化产物。

3.观察指标：收集患者的临床资料，包括入院当天心率、血压、血糖、血氧饱和度、血气、血常规、肝功能、肾功能、心肌酶谱及24 h 尿量(mL·24 h-1), 应用SOFA评分系统评估患者的SOFA评分值;同时用APACHEⅡ评分量表，收集每例患者最初24 h内各项指标的最差值及既往病史填入量表，进行APACHEⅡ评分。住院期间，记录各组患者MODS的例数，比较不同组间MODS的发生率的差异。

三、统计学分析

结 果

一、限制性内切酶Alw44 I消化PCR扩增产物电泳结果

PCR产物经限制性内切酶消化后，当该位点二等位基因均为纯合子Q/Q时，PCR产物不被酶切，显示99bp一条带；当该位点二等位基因均为纯合子R/R时，PCR产物均被酶切，产生31bp和68bp两条带；当该位点二等位基因为杂合子Q/R时，则显示31bp、68bp和99bp三条带。140例患者的PON-1基因型Q/Q 30例，Q/R 79例，R/R 31例。

二、不同基因组间SOFA 评分比较

不同基因组间SOFA 评分值(表1)。Q/Q基因型组SOFA 评分值高于Q/R及R/R基因型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同基因组间SOFA 评分的比较

注：a与Q/Q基因型比较:P<0.05

三、不同基因型间预后情况比较

基因型Q/Q、Q/R 和R/R组的MODS与死亡发生情况(表2)。Q/Q基因型组APACHE-Ⅱ评分及MODS发生率均高于Q/R及R/R基因型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 不同基因型组间APACHE-Ⅱ评分及MODS发生率的比较

注：a与Q/Q基因型比较:P<0.05

讨 论

AOPP在我国仍是最常见的农药中毒。AOPP主要抑制体内胆碱酯酶，导致乙酰胆碱在体内大量聚焦，引起呼吸、循环、神经等多系统功能紊乱，产生M样及N样和中枢神经系统症状，严重患者可致机体多器官功能损伤，甚至死亡，据统计文献报道的病死率高达8.16%[3]。随着研究不断深入，人们对有机磷中毒易感性的关系有了更多认识。人类PON-1基因具有多态性，多态性主要表现在第192位点和第55位点。在第192个位点上，Q同功酶为谷氨酰胺，即Gln192(PON1192)；R同功酶为精氨酸，即Arg129(PON1129)。在第55个位点上，L同功酶为白氨酸，即Leu55 (PON155)；M同功酶为蛋氨酸, 即Meth55(PON155)[4]。Mackness等[5]经多元回归分析发现, PON 的活性与其第192 位点多态性、第55位点多态性及血清中PON-1的浓度有关, 三者决定PON-1活性的高低分别占46%、13%和16%,而未发现其他因素可明显影响其活性。血浆PON-1能在活性有机磷代谢物进入组织前将之水解。现已证明:(1)低PON-1的动物对有机磷杀虫剂更易中毒；(2)纯化的PON-1酶能预防啮齿类动物发生对氧磷和毒死蜱中毒；(3)PON-1基因敲除的小鼠对毒死蜱中毒的易感性增加；(4)海湾战争中发生神经中毒症状的人比对照组Q同功酶的活性低。所有这些都说明PON-1的遗传基因水平的不同可能对暴露于有机磷者的临床病程有一定作用[6]。PON-1对有机磷水解作用强弱是决定有机磷对脊椎动物包括人毒性作用大小的重要因素, 而PON-1的此种保护作用又与PON-1的水平(含量) 及多态性(活性) 有关。

本研究的结果表明，在AOPP中，PON-1基因型为Q/Q患者的序贯器官衰竭评分( SOFA) 比Q/R及R/R型低，提示PON-1基因型为Q/Q患者的病情较重，发生器官衰竭的风险高于Q/R及R/R型；另外PON-1基因型为Q/Q患者MODS的发生率比Q/R及R/R型高，提示Q/Q性的急性有机磷中毒的患者更容易发生MODS。我们同期的研究已表明PON-1的基因多态性通过决定PON-1的活性，对机体的解毒能力造成影响，从而影响到AOPP患者的血清胆碱酯酶活性、呼吸衰竭发生率、住院时间[7]。

笔者对PON-1基因多态性与临床病情及预后关系的研究与既往的研究结果类似。张丽和赵敏[8]发现，AOPP患者的血PON-1活性明显降低，随着病情加重而下降，表明血PON-1参与有机磷水解消耗而减少，因此可以通过检测其活性来判断患者病情和预后。国内学者分离提纯兔血清的PON-1，预处理注入敌敌畏中毒大鼠体内，发现胆碱酯酶活力明显改善，中毒程度减轻[9]。甚至有动物研究证明PON-1在预防有机磷中毒的效果明显优于阿托品、氯解磷定联用，且其效果同剂量有显著的正相关性，而且毒副作用小[10]。

综上所述，PON-1的基因多态性通过影响PON-1的活性，影响急AOPP患者对毒物的降解，从而影响患者器官功能衰竭的发生率。检测PON-1活性及分析其基因多态性，可有助于筛查出有机磷农药接触人群的易感个体、保护易感人群；以及可预测有机磷农药中毒患者的病情及预后，有助于临床医师及时加强易感染人群的救治，减少严重并发症及病死率。同时，由于其PON-1能直接裂解、破坏有机磷分子，PON的底物范围广，解毒用量少但活力高，若能够通过基因重组的方式大量生产，或将为有机磷农药中毒的防治提供一种全新的安全有效的方法。

1 郭欣，于永光，王丹，等.急性有机磷农药中毒患者血尿胱抑素C的变化及意义[J].中国急救医学，2010，30(2)：159-161.

2 王云，常志文.PON1-192 Gln/Arg多态性与2型糖尿病合并冠心病的相关性[J]. 广东医学，2003，6(20)：598-600.

3 姚冬奇，田英平.2013急诊医学回顾与展望：急性中毒[J].中国急救医学，2014，34(1)：14-17.

4 Humbert RS，Adler DA，Disteche CM，et al. The molecular basis of the human serum paraoxonase activity polymorphism[J].Nat Genet，1993，3(1)：73-76.

5 Mackness B，Mackness M，Arrol S，et al. Effect of the molecular polymorphisms of human paraoxonase (PON1) on the rate of hydrolysis of paraoxon[J].J Pharmacol，1997，122(2)：265-268.

6 何庆，万智，唐伦先.有机磷中毒救治与预防的重大进步-PON1研究进展[J]. 中华急诊医学杂志，2003，12(6)：425-426.

7 周宁，姚为学,李志文，等.PON-1基因多态性对急性有机磷中毒患者病情的影响[J]. 广东医学，2015，36(11)：1673-1675.

8 张丽，赵敏.对氧磷酶1与有机磷中毒病情的关系[J].中外健康文摘，2014，(8)：147-148.

9 Wang NN，Yuan L，Dai H，et al. Effect of PON1 on dichilorvos toxicokinetics[J].Emerg Med J，2011，28(4)：313-315．

10 赵维，崔明.兔血清对氧磷酶在防治有机磷中毒中的作用[J].沈阳医学院学报，2014，16(3)：138-140.